錢凱，車文軍，盧劍，武中平，王燕芹

摘 要：建立固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）測(cè)定肉制品中玫瑰桃紅R含量的分析方法。試樣經(jīng)乙腈水溶液超聲提取，Oasis WAX柱凈化后，以乙腈-乙酸銨緩沖溶液為流動(dòng)相，經(jīng)C18柱分離后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。玫瑰桃紅R在0.5～10.0mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999。1.0、2.0、10.0mg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為90.6%～105.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為1.79%～4.25%，檢出限為0.26mg/kg。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定量準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；固相萃??；肉制品；玫瑰桃紅R；測(cè)定

Determination of Bordeaux R in Meat Products by SPE-HPLC

QIAN Kai1，CHE Wen-jun1，*，LU Jian1，WU Zhong-ping1，WANG Yan-qin2

（1. Jiangsu Product Quality Testing and Inspection Institute， Nanjing 210007， China；

2. College of Science， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China）

Abstract：A solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography （SPE-HPLC） method was developed for the determination of bordeaux R in meat products. Samples were extracted with aqueous acetonitrile solution under ultrasonication， and cleaned up by Oasis WAX solid phase extraction. The separation of bordeaux R was carried out on a C18 column using acetonitrile-ammonium acetate buffer as mobile phase. The prepared calibration curve was linear between 0.5 and 10.0 mg/L with correlation coefficient more than 0.999. The mean recoveries at spiked levels of 1.0， 2.0 and 10.0 mg/kg were in the range of 90.6% to 105.2% with RSDsof 1.79% to 4.25% （n = 6）. The limit of detection was 0.26 mg/kg. The SPE-HPLC method was sensitive， reproducible and accurate.

Key words：high performance liquid chromatography （HPLC）；solid phase extraction （SPE）；meat products；bordeaux R；determination

中圖分類號(hào)：O657.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2013）01-0035-03

近年來(lái)，在肉制品中違法添加工業(yè)合成染料的事件頻繁發(fā)生。如在鹵制雞腿、雞翅的生產(chǎn)過(guò)程中添加酸性橙；在臘腸的制作中加入羅丹明B；在冷凍蝦仁中檢出酸性紅等。這些工業(yè)染料可誘發(fā)人體癌變或引起人體皮膚、黏膜或呼吸道過(guò)敏，對(duì)人體健康危害極大。

鑒于工業(yè)染料對(duì)人體健康的危害性，目前食品中工業(yè)染料的檢測(cè)技術(shù)研究較受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道采用液相色譜[1-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[7-16]等方法對(duì)食品中多種工業(yè)染料進(jìn)行分析，但對(duì)于食品包括肉制品中玫瑰桃紅R的測(cè)定還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用固相萃取凈化技術(shù)，建立高效液相色譜法二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定肉制品中玫瑰桃紅R含量的方法，該方法高效、靈敏、快捷，能夠滿足我國(guó)肉制品的市場(chǎng)監(jiān)督與企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量控制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

王中王火腿腸 河南雙匯集團(tuán)；精制豬肉脯 靖江雙魚(yú)食品有限公司。

甲醇、乙腈、乙酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；氨水、甲酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Oasis WAX SPE柱（60mg/3mL）和Oasis HLB SPE柱（60mg/3mL） 美國(guó)Waters公司；玫瑰桃紅R 德國(guó)Dr. Ehrenstofer GmbH公司；玫瑰桃紅R用75%乙腈水溶液配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；提取液為75%乙腈水溶液，淋洗液為2%氨水溶液，洗脫液為1%鹽酸-甲醇溶液。

1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；固相萃取裝置 美國(guó)Varian公司；超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；渦旋振蕩儀 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取試樣1.0g（準(zhǔn)確至0.1mg）于50mL離心管中，加入5mL提取液，渦旋混合1min后，超聲提取20min，以8000r/min冷凍離心5min，收集上清液于試管中。殘?jiān)儆?mL提取液重復(fù)提取一次，合并兩次上清液；將上清液過(guò)Oasis WAX固相萃取柱（先依次用3mL甲醇、3mL水活化）后，用5mL淋洗液淋洗小柱，減壓抽干，用5mL洗脫液洗脫，整個(gè)萃取過(guò)程控制流速約為1mL/min；收集洗脫液，氮?dú)獯抵两?，用流?dòng)相溶解并定容至2.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后供HPLC分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：A為水（含10mmol/L乙酸銨，pH3.0），B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：520nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑選擇的合適與否會(huì)直接影響方法的回收率。玫瑰桃紅R在水中有較好的溶解性，在甲醇、乙腈等極性溶劑中也有一定的溶解性。根據(jù)肉制品的基質(zhì)特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)分別選用甲醇、乙腈、乙腈-水溶液作為提取溶劑進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇和乙腈的提取效率沒(méi)有明顯差別；而考察不同比例的乙腈水溶液的提取效率時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙腈體積分?jǐn)?shù)在75%時(shí)提取效率最高，因此，最終選用75%乙腈水溶液作為提取溶劑。

2.2 SPE凈化過(guò)程的優(yōu)化

考慮到用75%乙腈水溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取時(shí)，會(huì)將一些干擾物質(zhì)提取出來(lái)，如油脂、食品添加劑等。如果對(duì)提取液過(guò)濾后直接進(jìn)樣，一方面，在分析過(guò)程中會(huì)存在較大的干擾；另外，方法檢出限也達(dá)不到分析要求。而玫瑰桃紅R的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)苯環(huán)，可以使用反相機(jī)理的固相萃取柱進(jìn)行凈化；同時(shí)，玫瑰桃紅R屬于酸性染料，分子結(jié)構(gòu)中帶有磺酸基團(tuán)，因此在酸性條件下可以使用陰離子交換萃取柱進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)比較了Oasis HLB和Oasis WAX兩種固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果顯示，采用HLB固相萃取柱時(shí)，在萃取過(guò)程中容易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，導(dǎo)致回收率較低，僅為15.2%～27.3%；采用WAX固相萃取柱時(shí)，發(fā)現(xiàn)萃取過(guò)程相對(duì)容易，凈化、富集效果理想，平均回收率為90.6%～105.2%，符合分析要求。

2.3 HPLC條件的優(yōu)化

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將玫瑰桃紅R的標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)200～700nm的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描，得到其吸收光譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玫瑰桃紅R在波長(zhǎng)520nm處有較大吸收。綜合考慮組分的響應(yīng)值及干擾情況，最終確定定量檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇

玫瑰桃紅R屬于較強(qiáng)極性離子化合物，在反相色譜中，流動(dòng)相的pH值對(duì)其保留時(shí)間、峰形有影響。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[2-6]報(bào)道，選擇了乙腈-乙酸銨水溶液、乙腈-水（0.1%～0.5%甲酸）體系為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較了不同體積比、不同乙酸銨濃度、不同pH值條件下對(duì)玫瑰桃紅R的保留時(shí)間、響應(yīng)值和峰形的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乙腈-10mmol/L乙酸銨水溶液（用乙酸調(diào)pH值為3.0）的流動(dòng)相體系中，采用梯度洗脫能在較短時(shí)間實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的有效分離，峰形對(duì)稱，靈敏度高，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 1.0mg/L玫瑰桃紅R標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

Fig.1 Chromatogram of 1.0 mg/L bordeaux R standard solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法檢出限

準(zhǔn)確移取0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mL上述100mg/L儲(chǔ)備溶液分別置于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作線性回歸方程，以3倍信噪比計(jì)算檢出限。結(jié)果表明，玫瑰桃紅R在0.5～10.0mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，方法檢出限為0.26mg/kg，具有較高的靈敏度。組分的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及檢出限見(jiàn)表2。

注：Y.峰面積；X.標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）。

2.5 方法的回收率與精密度

在空白樣品中添加1.0、2.0、10.0mg/kg 3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，按上述色譜條件和前處理方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)處理6次，平均回收率及RSD見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為90.6%～105.2%，RSD為1.79%～4.25%，方法具有較好的回收率與精密度，滿足肉制品中玫瑰桃紅R含量檢測(cè)的要求。圖2為空白樣品及加標(biāo)的色譜圖。

圖 2 空白樣品（A）與空白樣品加標(biāo)（B）的色譜圖

Fig.2 Chromatograms of blank sample（A） and blank sample spiked with bordeaux R（B）

2.6 方法的實(shí)際應(yīng)用

應(yīng)用所建立的檢測(cè)方法，對(duì)肉脯、香腸等20多個(gè)肉制品樣品進(jìn)行測(cè)定，以保留時(shí)間和紫外-可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行定性，均未檢出含有玫瑰桃紅R殘留。

3 結(jié) 論

本研究建立了測(cè)定肉制品中玫瑰桃紅R含量的SPE-HPLC分析方法，通過(guò)對(duì)提取溶劑、凈化方式、檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相等參數(shù)的研究，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果表明，采用SPE方式凈化試樣，可有效地減少基質(zhì)的干擾、提高方法的靈敏度；同時(shí)考察了方法的回收率、精密度和檢出限，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合分析要求，可為管理部門加強(qiáng)肉制品監(jiān)管提供技術(shù)支持。

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