曹瑩瑩，張亮，王鵬，周光宏，徐幸蓮

摘 要：肌球蛋白溶液先經(jīng)100～600MPa壓力預(yù)處理10min，處理溫度20℃，后加熱制備凝膠，以未超高壓處理組為對(duì)照組，測(cè)定凝膠質(zhì)構(gòu)和保水性，采用傅里葉紅外光譜法測(cè)定肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，然后通過(guò)相關(guān)系數(shù)矩陣法研究肌球蛋白7種質(zhì)構(gòu)特性、保水性與各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的關(guān)系。結(jié)果表明：不同超高壓處理對(duì)肌球蛋白凝膠硬度的影響不顯著，對(duì)凝膠保水性影響顯著，隨著壓力升高，凝膠保水性逐漸下降。與對(duì)照組相比，100、200MPa處理的凝膠保水性無(wú)顯著差異；與對(duì)照組相比，300MPa以上處理的凝膠保水性顯著減少。超高壓致使肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，使蛋白質(zhì)β-折疊等有序結(jié)構(gòu)減少而β-轉(zhuǎn)角等無(wú)序結(jié)構(gòu)增加。從相關(guān)性分析結(jié)果得出，凝膠的黏附性、彈性、保水性與各二級(jí)結(jié)構(gòu)之間存在顯著的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：超高壓；肌球蛋白；凝膠；傅里葉紅外光譜；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

Combined Effect of Ultra High Pressure and Heating on Gel Properties and Secondary Structure of Myosin

CAO Ying-ying1，2，ZHANG Liang2，WANG Peng1，ZHOU Guang-hong1，XU Xing-lian1，*

（1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， National Center of Meat Quality and Safety Control， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China； 2. Huangshan University， Huangshan 245041， China）

Abstract：For the preparation of heat-induced myosin gels， myosin solution was subjected to ultra high pressure （UHP） pretreatment at 100—600 MPa and 20 ℃ before heat treatment. Heat-induced myosin gels with and without UHP pretreatment were determined for texture properties and water-holding capacity. Fourier transform infrared spectroscopy was used to examine secondary structure changes of myosin. In addition， the relationships of secondary structure contents with 7 texture parameters and water-holding capacity was analyzed using a correlation coefficient matrix. The results obtained demonstrated that UHP pressure did not significantly influence the hardness of myosin gels but had a significant negative correlation with the water-holding capacity. UHP treatments at 100 MPa and 200 MPa did not cause significant differences in the water-holding capacity of myosin gels in comparison with control groups， although UHP treatments at a pressure level higher than 300 MPa resulted in a significant reduction in the water-holding capacity of myosin gels. The molecular structure of myosin was unfolded after UHP treatment， causing a decrease in the amount of ordered structures such as β-sheet and an increase in the amount of unordered structures such as β-turn. Heat-induced myosin gels showed a significant correlation of secondary structure contents with adhesiveness， springiness and water-holding capacity.

Key words：ultra-high pressure；myosin；gels；FT-IR spectroscopy；protein structure

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2013）01-0001-07

超高壓技術(shù)（ultra high pressure processing，UHPP），可簡(jiǎn)稱高壓技術(shù)（high pressure processing，HPP），靜水壓技術(shù)（high hydrostatic pressure，HHP）。食品超高壓技術(shù)就是將食品原料包裝后，密封于超高壓容器中（常以水或其他流體介質(zhì)作為傳遞壓力的媒介物），利用100MPa以上的壓力（常用的壓力范圍是100～1000MPa），在一定的溫度下加工適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，引起食品成分、非共價(jià)鍵（氫鍵、離子鍵和疏水鍵等）的破壞或形成，使食品中的酶、蛋白質(zhì)、淀粉等生物高分子物質(zhì)分別失活、變性和糊化，并殺死食品中的細(xì)菌等微生物，從而達(dá)到食品滅菌保藏和加工的目的。超高壓處理對(duì)食品作用均一、迅速，不受體積和形狀的限制，對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味破壞較小。

肌肉蛋白質(zhì)占肉總質(zhì)量的15%～22%，是肉中具有重要生物學(xué)功能特性的組成成分。肌球蛋白是肌肉中含量最高最重要的蛋白質(zhì)，約占肌肉總蛋白質(zhì)的1/3，它的功能特性決定肉制品的質(zhì)構(gòu)、感官品質(zhì)、切片性、保水性、乳化穩(wěn)定性和產(chǎn)品得率。在肌肉凝膠形成過(guò)程中，肌球蛋白發(fā)生復(fù)雜的功能特性及結(jié)構(gòu)變化，這些變化受溫度、壓力、pH值、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、不同肌肉類型及添加物的影響。

蛋白質(zhì)分子是由氨基酸殘基首尾相連而成的共價(jià)多肽鏈組成，每一種天然蛋白質(zhì)都具有自己特定的空間結(jié)構(gòu)，這種空間結(jié)構(gòu)通常稱為蛋白質(zhì)分子構(gòu)象。氨基酸序列決定了蛋白質(zhì)的基本特性，因此被稱為一級(jí)結(jié)構(gòu)。一般而言，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化引起其功能性質(zhì)的變化，蛋白質(zhì)的功能主要由其特有的三維空間結(jié)構(gòu)所決定[1]。一般的加熱或者超高壓處理不能改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)側(cè)鏈（伸出鏈）間的氫鍵、靜電相互作用、疏水作用、范德華力和二硫鍵來(lái)維持的；而二級(jí)結(jié)構(gòu)是通過(guò)蛋白質(zhì)主鏈上C=O和N—H間的氫鍵作用來(lái)維持。

超高壓處理改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，100～150MPa改變蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)，大于200MPa改變蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，改變蛋白質(zhì)疏水性和巰基含量[2]；大于700MPa的壓力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不可恢復(fù)的變性[3]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性和食品品質(zhì)有重要的影響[4]。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法，主要有激光拉曼光譜法、圓二色譜法及傅里葉紅外光譜法等。拉曼光譜信噪比低，酰胺Ⅰ帶本身的信號(hào)強(qiáng)度低，受熒光背景干擾；圓二色譜法只能應(yīng)用在很低濃度范圍內(nèi)的澄清溶液中。傅里葉紅外光譜法可以測(cè)定任何氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)樣品。

紅外在多個(gè)波段對(duì)蛋白質(zhì)中與二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的C=O、N—H和C—N的不同振動(dòng)方式有吸收，其中，酰胺Ⅰ帶（1600～1700cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1220～1330cm-1）常被用來(lái)指認(rèn)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；酰胺Ⅲ帶能排除水峰的影響，與已知的二級(jí)結(jié)構(gòu)有很好的吻合，但其吸收是多種振動(dòng)吸收的加和，無(wú)法用簡(jiǎn)明的理論來(lái)解釋，因此，本研究用酰胺Ⅰ帶（1600～1700cm-1）研究其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。對(duì)于酰胺Ⅰ帶經(jīng)過(guò)譜峰擬合后各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，目前研究的比較成熟[5]。

酰胺Ⅰ帶（1600～1700cm-1）的紅外吸收主要與C=O的伸縮振動(dòng)有關(guān)。1600～1639cm-1被指認(rèn)為β-折疊，1640～1650cm-1被指認(rèn)為無(wú)規(guī)則卷曲（C=O與水形成氫鍵）；1651～1660cm-1被認(rèn)為為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1661～1700cm-1被指認(rèn)為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[6]。

本研究采用傅里葉紅外光譜法結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件技術(shù)，測(cè)定不同壓力預(yù)處理結(jié)合加熱形成凝膠中肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)測(cè)定凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和保水性，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性進(jìn)行相關(guān)性分析，建立蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3月齡雄性新西蘭白兔（2.0～2.5kg），購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、Triton X-100、Tris、二硫蘇糖醇（DTT）、EDTANa2、氯化鎂、ATPNa2、牛血清蛋白（BSA）、溴化鉀均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waring Blender 8010ES高速度組織勻漿機(jī) 美國(guó)Waring公司；Beckman Avanti J-E高速離心機(jī) 美國(guó) Beckman Coulter公司；Ultra Turrax T25 BASIS高速勻漿器 德國(guó)IKA公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó) Stable Micro Systems公司；HH-42 水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；UV-2450島津紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；PH 211 HANNA 臺(tái)式酸度計(jì) 葡萄牙Hanna公司；MUL-9000H20純水機(jī) 昆山總馨機(jī)械有限公司；SIM-F124SANYO制冰機(jī) 日本三洋公司；NEXUS670型傅里葉紅外光譜儀器 美國(guó)尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

健康的新西蘭白兔，宰前充分休息過(guò)夜，以減少應(yīng)激。機(jī)械擊昏后切斷頸部血管，充分放血，迅速剝皮，去頭、內(nèi)臟、爪，先后用自來(lái)水、蒸餾水沖洗以去除血跡。將腰大肌（pasoas major，PM）剝離后，0.5h內(nèi)剔除可見脂肪和結(jié)締組織，切碎后稱質(zhì)量。在0～4℃條件下提取肌球蛋白。提取方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[8]。

1.3.3 超高壓-加熱凝膠制備

肌球蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液（0.6mol/L NaCl，pH6.5，20mmol/L NaCl）稀釋到約20mg/mL。肌球蛋白溶液放在5mL凍存管中（勿留空隙和氣泡），放在超高壓腔體中，在壓力100、200、300、400、500、600MPa條件下保壓10min，超高壓溫度為室溫20℃，對(duì)照組為傳統(tǒng)加熱凝膠即未高壓處理凝膠，高壓處理后的樣品置于水浴鍋中從20℃程序升溫（1℃/min）到70℃，保溫20min。凝膠在0～4℃條件下放置24h，進(jìn)行下述指標(biāo)測(cè)試。

1.3.4 凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)試

測(cè)試前，凝膠在室溫中放置平衡2h，然后用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)量，使用的參數(shù)為：Load cell：25kg；探頭：P5，5mm cylinder Stainless；Test mode option：TPA；Pre-Test Speed：1.0mm/s；Test Speed：1mm/s；Post-Test Speed：2mm/s；Distance：15.0mm；Trigger Force：8g；Trigger Type：Auto；Data Acquisition Rate：200pps；測(cè)試完成后，用儀器自帶軟件Texture Expert Exceed 2.64a對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行處理。每個(gè)處理做4個(gè)重復(fù)。測(cè)定指標(biāo)如下：硬度、彈性、回彈性、黏附性、黏聚性、膠黏性和膠黏性。

1.3.5 凝膠保水性測(cè)試

保水性（WHC）通過(guò)Kocher等[9]的離心法測(cè)量，肌原纖維蛋白凝膠在0～4℃條件下用10000×g離心10min，記錄離心前后離心管的質(zhì)量，離心出液體的質(zhì)量，每個(gè)處理有4個(gè)重復(fù)。按下式計(jì)算WHC。

式中：mML為離心過(guò)程中水分損失質(zhì)量/g，mCG為離心前凝膠的質(zhì)量/g。

1.3.6 肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定?（傅里葉紅外光譜法）

制備的凝膠在-80℃冷凍4h左右，再置于真空冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行冷凍干燥，直至凝膠完全干燥，用研缽將凝膠研成粉末，經(jīng)80目過(guò)濾篩過(guò)濾后，裝于10mL離心管中備用。

取出上述冷凍干燥處理后的凝膠與無(wú)水溴化鉀（約150～200mg）充分混合，在約1333.2Pa/cm2的壓力下加壓15min形成溴化鉀壓片。用紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)量和分析，分辨率為4cm-1，掃描累加32次，光譜觀察范圍為400～4000cm-1。主要測(cè)量1600～1700cm-1范圍內(nèi)酰胺Ⅰ譜帶，用Origin 8.5軟件分析位于1600～1700cm-1波段屬于酰胺Ⅰ帶特征峰的圖譜。先經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)，得到子峰數(shù)目在8～12之間，再校正基線，然后用 Gaussian曲線去卷積、進(jìn)行多峰擬合[10-11]。進(jìn)行多次擬合使殘差最小。根據(jù)峰面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的比率。各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系為：1600～1640cm-1為β-折疊；1640～1650cm-1為無(wú)規(guī)卷曲；1650～1658cm-1為α-螺旋；1660～1695cm-1為β-轉(zhuǎn)角。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差分析，如果方差分析效應(yīng)顯著，使用Duncan multiple range test進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓處理對(duì)肌球蛋白凝膠硬度的影響

由圖1可見，未超高壓組凝膠硬度為74.95g，與未超高壓組相比，100～300MPa處理的凝膠硬度下降（P>0.05），原因是蛋白質(zhì)分子被打開，水分子進(jìn)入，使凝膠硬度下降。胡飛華等[12]用300MPa超高壓處理魚糜后，發(fā)現(xiàn)凝膠硬度僅為熱處理的67%，在彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性、持水性和白度方面，超高壓處理組均高于熱處理組，其中彈性增加明顯，為熱處理的1.6倍。與未超高壓組100、200、300MPa相比，400MPa處理的凝膠硬度達(dá)到最高值為75.19g（P>0.05），原因是蛋白質(zhì)分子變性，分子聚集增加，硬度升高。Kajiyama等[13]發(fā)現(xiàn)，和傳統(tǒng)的通過(guò)熱處理加工獲得的豆腐相比，超過(guò)300MPa壓力形成的凝膠具有更大的硬度。說(shuō)明一定的壓力，可以提高凝膠類產(chǎn)品的硬度。與前4組凝膠相比，500、600MPa的硬度下降（P>0.05），但并不顯著。王苑等[14]將雞肉肌原纖維蛋白和大豆分離蛋白按體積比1：1混合的凝膠經(jīng)100MPa超高壓預(yù)處理后，經(jīng)55℃加熱20min可以形成較好的凝膠，硬度、彈性、保水性比未經(jīng)超高壓處理的分別提高了35.50%、27.71%、47.29%。張宏康等[15]用400MPa、45℃條件下獲得最高的大豆蛋白凝膠強(qiáng)度，而在500MPa 壓力，35℃和45℃條件下，凝膠強(qiáng)度下降。在實(shí)際生產(chǎn)中，控制小于400MPa的壓力對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)有利。

圖 1 不同高壓處理對(duì)肌球蛋白凝膠硬度的影響

Fig.1 Effect of UHP treatment at different pressure levels on the hardness of myosin gels

2.2 高壓處理對(duì)肌球蛋白凝膠保水性的影響

圖 2 不同高壓處理對(duì)肌球蛋白凝膠保水性的影響

Fig.2 Effect of UHP treatment at different pressure levels on the water-holding capacity of myosin gels

由圖2可見，未超高壓組凝膠保水性為61.15%，與未超高壓組相比，100、200MPa處理的凝膠保水性下降（P>0.05），與未超高壓組及100、200MPa高壓處理相比，300MPa以上的壓力，凝膠保水性顯著下降（P<0.05），而300、400、500、600MPa的凝膠保水性無(wú)顯著差異（P>0.05）。原因是，壓力超過(guò)300MPa，蛋白質(zhì)分子發(fā)生部分或者完全變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降，再加熱處理致使蛋白質(zhì)分子失水，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[13-18]結(jié)果不同，可能是由于研究材料不同和測(cè)定保水性方法不同所致。壓力處理降低肌球蛋白凝膠保水性的另一原因可能是，超高壓處理使肌球蛋白分子的疏水性增加，分子之間結(jié)合更加緊密，分子空隙減少，保留水分的空間減少。

2.3 高壓處理對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

a～g. 分別為未超高壓處理組及100、200、300、400、500、600MPa處理組。圖4、5同。

圖 3 不同高壓處理的肌球蛋白凝膠傅里葉紅外光譜圖

Fig.3 FT-IR spectrum of myosin gels with UHP treatment

由圖3可見，未超高壓處理組在1617cm-1和1638cm-1處有兩個(gè)大吸收峰，這是蛋白質(zhì)β-折疊的區(qū)域，100MPa處理組在1654cm-1有一大吸收峰，此處是α-螺旋的特征吸收峰，200MPa處理組在1641cm-1有一大吸收峰，在其附近還有1個(gè)并列的峰，此處是無(wú)規(guī)則卷曲的區(qū)域，300MPa處理組，在1654cm-1處有一大吸收峰，此處是α-螺旋的特征吸收峰，400MPa和500MPa處理組，都在1647cm-1處有一大吸收峰，此處是無(wú)規(guī)則卷曲的吸收峰區(qū)域。600MPa處理組，在1618cm-1和1637cm-1有兩個(gè)大的吸收峰，這是蛋白質(zhì)β-折疊的區(qū)域。未超高壓處理組和600MPa處理組，蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶，吸收峰形狀相似，但兩波數(shù)位置不同，都相差1cm-1。這表明傳統(tǒng)加熱肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與超高壓肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)不同。

圖 4 不同高壓處理的肌球蛋白凝膠傅里葉紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖

Fig.4 Second derivative FT-IR spectra of myosin gels with UHP treatment at different pressure levels

由圖4可見，二階導(dǎo)數(shù)圖中，重疊峰和小肩峰被明顯分離，總峰數(shù)在9～12個(gè)之間，符合處理規(guī)則。一般蛋白質(zhì)和多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)在紅外區(qū)有9～12個(gè)特征吸收帶[19]。觀察各種處理的每個(gè)峰帶，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有明顯的變化。波數(shù)出現(xiàn)紅移或者藍(lán)移，或者出現(xiàn)新峰。未超高壓處理組凝膠結(jié)構(gòu)有3個(gè)大而寬的吸收峰，100～500MPa的凝膠，峰形變小變窄，600MPa凝膠有3個(gè)大而寬的吸收峰，大峰上出現(xiàn)一小肩峰。

圖 5 不同高壓處理的肌球蛋白凝膠高斯擬合圖

Fig.5 Gaussian fitting of FT-IR spectra of myosin gels with UHP treatment at different pressure levels

各個(gè)壓力處理的肌球蛋白高斯擬合圖見圖5。經(jīng)過(guò)二階導(dǎo)數(shù)，去基線，高斯擬合，得到各個(gè)峰的吸收面積，然后計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，見表1。未高壓處理組蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，其次為β-轉(zhuǎn)角。100MPa預(yù)處理后再加熱的蛋白質(zhì)凝膠，β-折疊含量下降5%左右，無(wú)規(guī)則卷曲含量由14.35%增加為25.81%，β-轉(zhuǎn)角下降（P>0.05）。200MPa預(yù)處理后再加熱形成的凝膠，β-折疊含量下降2%，無(wú)規(guī)則卷曲含量升高至29.54%，α-螺旋含量未見明顯變化，β-轉(zhuǎn)角含量下降為14.23%。300MPa預(yù)處理后再加熱形成的凝膠，β-折疊含量下降至47.24%，無(wú)規(guī)則卷曲含量顯著下降至4.63%（P<0.05），α-螺旋含量增加，β-轉(zhuǎn)角含量極顯著增加為41.76%（P<0.01），壓力增加至300MPa，各二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。400MPa預(yù)處理后再加熱的凝膠，β-折疊含量下降為43.25%，無(wú)規(guī)則卷曲含量?jī)H為3.82%，α-螺旋含量顯著增加為16.08%（P<0.05），β-轉(zhuǎn)角含量下降至36.85%。500MPa預(yù)處理后再加熱的蛋白質(zhì)凝膠，β-折疊含量極顯著下降至9.63%（P<0.01），無(wú)規(guī)卷曲含量顯著增加至12.96%（P<0.05），β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加為66.22%（P<0.05），600MPa預(yù)處理后再加熱的蛋白質(zhì)凝膠，β-折疊含量最低，為8.37%。

對(duì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行多重比較，未高壓處理組（即為對(duì)照組）、100MPa預(yù)處理后再加熱組、200MPa預(yù)處理后再加熱組和300MPa預(yù)處理后再加熱組的無(wú)規(guī)則卷曲含量差異顯著（P<0.05），當(dāng)壓力在200MPa時(shí)，無(wú)規(guī)則卷曲含量達(dá)到最大值29.54%；300MPa預(yù)處理后再加熱組與400MPa預(yù)處理后再加熱組的無(wú)規(guī)則卷曲含量無(wú)顯著差異（P>0.05）；500MPa預(yù)處理后再加熱組、600MPa預(yù)處理后再加熱組的無(wú)規(guī)則卷曲含量與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），與其他組差異顯著（P<0.05）。

注：同一列上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

對(duì)照組與200MPa預(yù)處理后再加熱組的α-螺旋含量差異不顯著（P>0.05），與其他組差異均顯著（P<0.05）；隨著壓力增大，α-螺旋含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在壓力400MPa時(shí)，達(dá)到最大值16.08%。

隨著壓力增大，β-轉(zhuǎn)角含量顯著上升。當(dāng)壓力在500MPa時(shí)，β-轉(zhuǎn)角的含量極顯著升至70.47%（P<0.01），成為二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子結(jié)構(gòu)解折疊，埋藏的基團(tuán)被暴露所致。

超高壓處理改變肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的原因是，隨著處理壓力的增大，肌球蛋白分子間的氫鍵作用逐漸減小，分子間的相互作用逐漸減弱，其疏水結(jié)合及離子結(jié)合可能因體積的縮小被切斷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開，非極性基團(tuán)暴露出來(lái)，從而改變了肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[20]。本研究結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件二階導(dǎo)數(shù)和高斯擬合的方法定量計(jì)算峰面積，最終得到各二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量信息，與通過(guò)拉曼光譜法測(cè)定傳統(tǒng)加熱肌原纖維蛋白凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)含量相似[1]。

2.4 蛋白質(zhì)功能特性與結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

由表2相關(guān)性分析可知，保水性與β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲含量極顯著正相關(guān)（P<0.01），與α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），結(jié)果表明，蛋白質(zhì)分子折疊或者無(wú)規(guī)則卷曲時(shí)，分子有更多的空隙，能夠容納更多的水分；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子變?yōu)棣?螺旋狀或者β-轉(zhuǎn)角時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間空隙變小，保留水分的空間縮小，致使保水性降低。硬度與膠黏性顯著正相關(guān)（P<0.01），硬度高意味著凝膠膠黏性高。黏附性與黏聚性、咀嚼性、膠黏性顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與α-螺旋顯著正相關(guān)。黏聚性與咀嚼性和膠黏性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與彈性成顯著正相關(guān)（P<0.05）。咀嚼性與彈性正相關(guān)（P<0.05），與膠黏性極顯著正相關(guān)（P<0.01），彈性與α-螺旋顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3 結(jié) 論

不同超高壓處理對(duì)肌球蛋白凝膠硬度的影響不顯著，對(duì)凝膠保水性的影響顯著，隨著壓力升高，凝膠保水性逐漸下降。超高壓致使肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，使蛋白質(zhì)β-折疊等有序結(jié)構(gòu)減少而β-轉(zhuǎn)角等無(wú)序結(jié)構(gòu)增加。從相關(guān)性分析結(jié)果得出，凝膠的黏附性、彈性、保水性與各二級(jí)結(jié)構(gòu)之間存在顯著的相關(guān)性。

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