劉瑩瑩　羅瑞明　盧君逸　胡聰

摘 要：為研究冷卻羊肉中微生物與理化指標(biāo)之間的關(guān)系及建立優(yōu)勢腐敗菌生長預(yù)測模型，文中對冷卻羊肉的多個理化指標(biāo)和主要致腐微生物進(jìn)行研究。實(shí)驗測定了冷卻羊肉在4℃條件貯藏下菌落總數(shù)、pH值、揮發(fā)性鹽基氮和主要致腐微生物假單胞菌（Pseudomonas）的變化。結(jié)果表明：pH值為先下降后上升；揮發(fā)性鹽基氮值（TVB-N）和失水率初期平穩(wěn)上升，后期快速增大。在4、7、10、15、20℃條件下，利用Matlab7.0擬合實(shí)驗數(shù)據(jù)，得到Gompertz一級模型和平方根二級模型，對預(yù)測模型在4℃和10℃條件下進(jìn)行驗證，準(zhǔn)確度在20%以內(nèi)，可以有效地預(yù)測冷卻羊肉中假單胞菌的生長變化。

關(guān)鍵詞：冷卻羊肉；假單胞菌；pH值；揮發(fā)性鹽基氮；預(yù)測模型

Predictive Modelling of Quality Changes and Pseudomonas Growth during Chilled Storage of Mutton

LIU Ying-ying，LUO Rui-ming*，LU Jun-yi，HU Cong

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract：The relationships between microbial and physiochemical properties for chilled mutton were investigated and predictive models for the growth of the major pathogenic bacteria Pseudomonas were established. Total bacterial colony， pH， total volatile basic nitrogen （TVB-N） and Pseudomonas count were measured during chilled storage of mutton at 4 ℃. The results showed that pH initially rose and then fell， TVB-N increased slowly at the early stage of storage and rapidly at the later stage. Gompertz models and square-root models describing the growth of Pseudomonas at 4， 7， 10， 15 ℃ and 20 ℃ were fitted with Matlab 7.0 software. The growth models at 4 ℃ and 10 ℃ were valiated. Accuracy was observed within 20%， indicating good prediction capability.

Key words：chilled mutton；Pseudomonas；pH；TVB-N；prediction model

中圖分類號：TS251.53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）05-0005-05

冷卻肉是指對嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度屠宰后的鮮肉胴體迅速進(jìn)行冷卻處理，使鮮肉胴體在24h內(nèi)迅速降至0～4℃，并在鮮肉后續(xù)的加工、流通和零售的過程中始終保持在0～4℃的一種新型遇冷加工肉[1]。冷卻肉含有豐富的營養(yǎng)成分，成為未來肉類產(chǎn)品消費(fèi)的主流[2]，但是在加工、貯藏、運(yùn)輸、銷售過程中，由于冷鏈系統(tǒng)不夠完善，容易受微生物的污染，導(dǎo)致冷卻肉的腐敗變質(zhì)[3]。

引起冷卻肉腐敗變質(zhì)的主要是一些嗜冷菌的生長活動，研究優(yōu)勢腐敗菌的生長變化對于控制冷卻肉的品質(zhì)是十分關(guān)鍵的。利用數(shù)學(xué)預(yù)測模型可以有效地預(yù)測微生物的生長，快速對優(yōu)勢腐敗菌的生長、存活和死亡進(jìn)行預(yù)測[4]，為冷卻肉的質(zhì)量安全提供依據(jù)。微生物預(yù)測模型是以數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)，通過適當(dāng)?shù)脑囼?，得到微生物與各因素之間關(guān)系數(shù)據(jù)[5]。初級模型表示微生物響應(yīng)與時間關(guān)系，次級模型描述環(huán)境因子的變化如何影響初級模型中的參數(shù)[6]。

國內(nèi)外對于水產(chǎn)品、禽肉類、牛肉、豬肉等肉類中優(yōu)勢腐敗菌預(yù)測模型的研究已有一些報道，而對冷卻羊肉中優(yōu)勢腐敗菌預(yù)測模型建立的研究則很少有報道[7]。本實(shí)驗通過研究冷卻羊肉貨架期低溫儲藏過程中，微生物的生長變化規(guī)律、分析理化指標(biāo)的變化，客觀的評價冷卻羊肉的品質(zhì)，初步了解微生物在冷卻羊肉貯藏中的變化，找出微生物生長與肉品質(zhì)之間的相關(guān)性[8]，建立假單胞菌（Pesudomonades）生長預(yù)測預(yù)報模型，為冷卻羊肉生產(chǎn)中潛在危害的確定提供理論依據(jù)，最終達(dá)到對產(chǎn)品質(zhì)量安全的控制。

1 材料與方法

1.1 材料

冷卻羊肉 寧夏澇河橋牛羊肉產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150B生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；TDL-4-A青島低速離心分離機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；PHSJ-3F便攜式pH計 上海精科儀器有限公司；LRH生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；HDL-APPARATUS超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

取羊后腿肉，用保鮮膜包裹，迅速轉(zhuǎn)移到實(shí)驗室中冷藏放置。垂直于肌纖維方向切成5cm×5cm×（1～2）cm大小的肉塊，每塊肉質(zhì)量25.00g，分成8組，每組6塊均等大小的肉塊，將分組后的肉塊裝入托盤后以保鮮膜粘貼包裝，4℃恒溫培養(yǎng)箱中分別儲存0、2、4、6、8、10、12、14d。

1.3.2 細(xì)菌菌落總數(shù)的測定

每隔1d無菌操作取25.00g羊肉，用滅菌剪刀剪碎置于均質(zhì)拍打袋中，加入225mL滅菌生理鹽水，用均質(zhì)器拍打1min，然后按照1：10比例稀釋，按照GB4789.22008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》用稀釋平板法測定細(xì)菌菌落總數(shù)[9]。

1.3.3 主要腐敗菌的測定

樣品處理方法同上，選用以下選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行測定。不同微生物培養(yǎng)條件見表1。

表 1 不同微生物的培養(yǎng)條件

Table 1 Culture conditions for different microorganisms

種類 選擇性培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件

乳酸菌Lactobacillus MRS 37℃、48h

假單胞菌Pesudomonade 瓊脂 30℃、48h

腸桿菌E.coli VRBDA 37℃、48h

葡萄球菌Staphylococcus MSA 37℃、48h

1.3.4 pH值的測定

每隔1d取出25.00g肉樣3份，作為3個平行，剪碎攪勻，分別置于燒杯中。由拍打器進(jìn)行拍打后用便攜式pH計按照GB9695.5—2008《肉與肉品pH測定》中的方法測冷卻羊肉浸出液的pH值，每個樣品測定5次，取平均值。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮的測定

每隔1d取相應(yīng)肉樣10.00g絞碎攪勻，分別置于錐形瓶中，加入100mL水，不時振搖，浸漬30min后過濾，濾液置冰箱中備用。按半微量凱氏定氮法測定揮發(fā)性鹽基氮的含量[10]。

1.3.6 失水率的測定

低速離心法：離心速度為4000r/min，離心時間為 5min，試樣5g。

式中：M：離心之前的質(zhì)量/g；m：離心之后的質(zhì)量/g。

1.3.7 優(yōu)勢腐敗菌預(yù)測模型的建立

樣品處理同上，肉塊用保鮮袋包裝，分別放在不同溫度4、7、10、15、20℃恒溫培養(yǎng)貯藏，每個溫度取樣點(diǎn)設(shè)置3個平行，每隔1d取樣一次，測定主要腐敗菌在不同恒定溫度下菌落的數(shù)量。

1.3.7.1 一級模型的建立

用GomPertz方程描述不同溫度條件下的生長動態(tài)[11]，GomPertz方程式如下：

式中：N（t）是微生物在時間t時菌落數(shù)的常用對數(shù)值（lg（CFU/g））；N0是隨時間無限減小時漸進(jìn)對數(shù)值，相當(dāng)于初始菌落數(shù)的對數(shù)值（lg（CFU/g））；Nmax是增加到穩(wěn)定期時最大的菌落數(shù)量對數(shù)值（lg（CFU/g））；μmax是微生物生長的最大比生長速率/h-1；Lag是微生物生長的延滯時間/h；t是貯藏時間/d。

1.3.7.2 二級模型的建立

用平方根（Belehradek）方程的描述效果簡單有效[12]，方程式如下：

式中：T是培養(yǎng)溫度/℃；Tmin是一個假設(shè)的概念，指的是微生物沒有代謝活動時的溫度，即在此溫度是最大比生長速率為零；b是方程的常數(shù)。

將一級模型求得的Lag和對應(yīng)的溫度變量代入方程式，擬合出bLag、Tmin、μmax、bμmax這四個參數(shù)值。將所得參數(shù)值代回原等式，即完成二級模型的建立。

1.3.7.3 模型的驗證

應(yīng)用建立的微生物生長動力學(xué)模型求得4℃和10℃貯藏時的預(yù)測值，采集的肉樣在4℃和10℃貯藏實(shí)驗中實(shí)際檢測的微生物生長數(shù)值進(jìn)行比較，采用偏差度（bias factor，BF）和準(zhǔn)確度（accuracy factor，AF）來評價已經(jīng)建立的特定腐敗微生物生長動力學(xué)模型的可靠性[13]。

式中：N實(shí)測是實(shí)驗實(shí)際測得的微生物數(shù)量；N預(yù)測是應(yīng)用微生物生長動力學(xué)模型得到的與N實(shí)測同一時間的微生物數(shù)量；n是實(shí)驗次數(shù)。

1.3.7.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Matlab7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，并對模型進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷卻羊肉貯藏過程中微生物的變化規(guī)律

在4℃貯藏條件下，實(shí)驗得到微生物菌落總數(shù)的變化規(guī)律如圖1所示。

圖 1 4℃貯藏條件下冷卻羊肉菌落總數(shù)的變化

Fig.1 Change in total bacterial colony during chilled storage of mutton at 4 ℃

從圖1可看出，隨著貯藏時間的增加，微生物菌落總數(shù)前6d菌落總數(shù)略微下降，從第6天開始微生物菌落總數(shù)不斷增加，呈現(xiàn)快速增長趨勢，第12天，微生物有明顯的增長。原因是測定微生物總數(shù)時，可能微生物生長的延滯期或者是由于外界生長環(huán)境的改變，微生物需要適應(yīng)新的環(huán)境，生長緩慢[14]。從菌落總數(shù)變化曲線上可以看出，在4℃貯藏條件下，前10d冷卻羊肉中菌落總數(shù)都小于106CFU/g，達(dá)到冷鮮肉的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；從第10天開始菌落總數(shù)超過 106CFU/g，冷卻肉開始變質(zhì)。

2.2 冷卻羊肉中特定腐敗菌的初步鑒定

圖 2 4℃貯藏條件下冷卻羊肉主要腐敗菌的變化

Fig.2 Change in major spoilage bacteria during chilled storage of mutton at 4 ℃

冷卻羊肉的貯藏期間，致腐微生物是導(dǎo)致腐敗變質(zhì)的主要原因。從冷卻羊肉貯藏過程中主要腐敗菌的變化曲線圖2中可以看出，假單胞菌是導(dǎo)致冷卻羊肉腐敗的主要微生物。新鮮肉中本來不含有腸桿菌[15]，但在加工，清洗過程中會被污染，在低溫條件下，腸桿菌雖然能夠生長繁殖，但不是主要的腐敗菌。乳酸菌是厭氧菌，在貯藏過程中的生長繁殖會受到抑制。葡萄球菌的生長也比較緩慢，不是主要腐敗菌。

2.3 冷卻羊肉貯藏過程中pH值的變化規(guī)律

圖 3 4℃貯藏條件下冷卻羊肉pH值的變化

Fig.3 Change in TVB-N during chilled storage of mutton at 4 ℃

根據(jù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，動物死后進(jìn)入尸僵狀態(tài)，pH值會發(fā)生相應(yīng)的變化。肉類在低pH值的情況下，能夠較好的保持新鮮度[16]。由圖3可知，本實(shí)驗中所選取的冷卻羊肉初始pH值呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢。分析其原因，pH值下降一是由于肌肉中糖原酵解產(chǎn)生了乳酸，二是由于三磷酸腺苷分解出磷酸，乳酸和磷酸不斷積累，導(dǎo)致羊肉的pH值的下降；但隨著羊肉的成熟，在細(xì)菌和多種酶作用下，肉中蛋白質(zhì)被分解成了氨類化合物等堿性物質(zhì)，使pH值不斷升高[17]，從圖3可知，從第12天羊肉的pH值迅速升高，說明了冷卻肉已開始腐敗。

2.4 冷卻羊肉貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮的變化規(guī)律

圖 4 4℃貯藏條件下冷卻羊肉TVB-N值的變化

Fig.4 Change in water loss rate during chilled storage of mutton at 4 ℃

從圖4可知，冷卻羊肉所含TVB-N的量，隨著冷卻羊肉腐敗變質(zhì)的進(jìn)行而不斷增加，在第10天后TVB-N值迅速升高且超過15mg/100g，由此得出實(shí)驗所用的冷卻羊肉在第10天時已經(jīng)腐敗[18]。但在第14天時TVB-N值有所降低，這可能與微生物進(jìn)入生長后期，活動減弱有關(guān)。

2.5 冷卻羊肉貯藏過程中失水率的變化規(guī)律

圖 5 4℃貯藏條件下冷卻羊肉失水率的變化

Fig.5 Changes of water loss rate in chilled mutton during the storage period at 4℃

從圖5可知，冷卻羊肉前10d失水率緩慢上升，但是到了第10天之后，失水率迅速升高，這是因為冷卻羊肉在第10天時已經(jīng)腐敗變質(zhì)，微生物大量生長需要水分，所以失水率升高，到后期微生物生長緩慢，失水率又有所降低。

2.6 假單胞菌預(yù)測模型的建立

2.6.1 一級模型的建立

根據(jù)4、7、10、15、20℃貯藏過程中，假單胞菌的生長實(shí)驗觀察值，用修正的GomPertz方程回歸描述假單胞菌的生長動態(tài)。試驗觀察值和擬合曲線如圖6所示。

圖 6 不同溫度下假單胞菌在冷卻羊肉上的生長擬合曲線

Fig.6 Fitted curves for the growth of Pseudomonas in chilled mutton at different temperatures

4、7、10、15、20℃下，假單胞菌在冷卻羊肉上的生長，Matlab 7.0統(tǒng)計分析軟件所得生長動力學(xué)參數(shù)見表2。

表 2 不同溫度下假單胞菌在冷卻羊肉上的生長動力學(xué)參數(shù)

Table 2 Kinetic parameters for the growth of Pseudomonas in chilled mutton at different temperatures

溫度/℃ N0（lg（CFU/g）） Nmax（lg（CFU/g）） μmax Lag/h 均方誤差（MSE） R2

4 3.0429 6.9241 0.0373 82.51 0.0392 0.9802

7 3.1429 7.3594 0.0562 60.12 0.0702 0.9915

10 2.9023 7.8895 0.0817 41.32 0.0452 0.9753

15 2.8583 8.1725 0.1174 29.18 0.0257 0.9813

20 3.1593 9.7478 0.1521 11.34 0.0304 0.9542

注：R2值越大，MSE值越小，回歸擬合效果越好。

根據(jù)軟件得出的參數(shù)，用修正的Modified Gompertz模型回歸得到方程式如下：

4℃：lgN=3.0429+3.8812exp{-exp[0.2340（4.5751-t）]}

7℃：lgN=3.1429+4.2165exp{-exp[0.3340（3.5652-t）]}

10℃：lgN=2.0923+4.9872exp{-exp[0.2517 （3.8210-t）]}

15℃：lgN=2.8583+5.3142exp{-exp[0.3612 （4.2925-t）]}

20℃：lgN=3.1593+6.5885exp{-exp[0.3154 （4.7813-t）]}

由表2可得知在4、7、10、15、20℃這五種溫度下的R2值均大于95%，MSE較小，說明方程均擬合得很好。

2.6.2 二級模型的建立

擬合最大比生長速率-溫度（μ1/2-T）曲線和延滯期-溫度（1/λ1/2-T），得到二級模型，如圖7、8所示。

圖 7 溫度與最大比生長速率的關(guān)系

Fig.7 Temperature dependence of μmax

圖 8 溫度與延滯時間的關(guān)系

Fig.8 Temperature dependence of Lag

由圖7、8可以看出，溫度和最大生長比率及延滯時間有很好的線性關(guān)系，模型的R2分別為0.9683和0.9353，擬合方程分別為：；

。

2.6.3 模型驗證

表 3 冷卻羊肉在4℃和10℃貯藏時假單胞菌數(shù)量預(yù)測值的

偏差度和準(zhǔn)確度

Table 3 Degree of deviation and accuracy for Pseudomonas growth prediction in chilled mutton at 4 ℃ and 10 ℃

貯藏溫度/℃ 實(shí)驗次數(shù) 偏差度（BF）/% 準(zhǔn)確度（AF）/%

4 5 13.6 15.2

10 5 12.4 14.2

在4℃和10℃條件下，重復(fù)實(shí)驗5次，得到實(shí)驗數(shù)據(jù)和模型預(yù)測值的偏差度和準(zhǔn)確度見表3。

由表3可知，實(shí)驗得出的假單胞菌數(shù)量和預(yù)測模型得出的假單胞菌數(shù)量的準(zhǔn)確度在20%以內(nèi)，說明實(shí)驗和模型得出的結(jié)果誤差比較小，所建立的模型的準(zhǔn)確度比較高。

3 結(jié) 論

3.1 冷卻羊肉的初始菌相的差異很大，主要微生物種類主要有假單胞菌、大腸桿菌、乳酸菌、葡萄球菌，其中嗜冷菌假單胞菌的數(shù)量最多，并且隨著貯藏時間的增加，表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢，是冷卻羊肉中主要腐敗菌。冷卻羊肉在第10天以后，揮發(fā)性鹽基氮、失水率明顯升高，從第10天開始菌落總數(shù)超過106CFU/g得出實(shí)驗所用的冷卻羊肉在第10天時已經(jīng)腐敗。

3.2 對恒定溫度下的冷卻羊肉建立假單胞菌的一級模型（Modified Gompertz方程），擬合度在0.95以上；平方根二級模型的R2值為0.9683，能擬合不同溫度下假單胞菌的生長速率，對預(yù)測模型進(jìn)行驗證，準(zhǔn)確度在20%以內(nèi)，可以動態(tài)地監(jiān)測冷卻羊肉中假單胞菌的生長情況控制冷卻肉的腐敗程度，進(jìn)而為判斷冷卻羊肉的衛(wèi)生和安全提供了有效的指導(dǎo)意見。

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