許倩　朱秋勁　葉春　王文秀

摘 要：利用低場核磁共振技術(shù)研究冰溫貯藏條件下無包裝與真空包裝牛肉在貯藏過程中水分弛豫參數(shù)的變化規(guī)律。通過馳豫測定，結(jié)果顯示新鮮牛肉中有3種不同活動狀態(tài)的水分，即結(jié)合水、不易流動水和自由水，其對應(yīng)的橫向弛豫時間分別是T21、T22、T23。對弛豫參數(shù)與常見肉品質(zhì)指標(biāo)進行皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析，揭示了兩者間的相關(guān)性。結(jié)果表明：無包裝牛肉自由水弛豫參數(shù)與其品質(zhì)指標(biāo)均有較強的相關(guān)性，而真空包裝牛肉的弛豫參數(shù)與其品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性均不強。對冰溫貯藏牛肉的品質(zhì)影響最大的水分是自由水，自由水的弛豫參數(shù)能夠很好的用于無包裝牛肉常規(guī)品質(zhì)指標(biāo)的研究。

關(guān)鍵詞：冰溫貯藏；真空包裝；低場核磁共振；牛肉；水分狀態(tài)

LF-NMR Studies of Variations of Different Water States during Controlled Freezing Point Storage of Beef

XU Qian1，ZHU Qiu-jin1，2，3，*，YE Chun1，WANG Wen-xiu1

（1. College of Life Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China；

2. Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province， Guiyang 550025， China；

3. National Beef Processing Technology Research and Detection Sub-centre， Huishui 550600， China）

Abstract：The aim of this study to apply low field NMR to investigate regular variations of different relaxation parameters of water in vacuum packaged beef and non-vacuum packaged beef during controlled freezing point storage. NMR relaxation data indicated that there were three different types of water in fresh beef， namely bound water， free water and immobilized water with relaxation times of T21， T22 and T23 （x-axis）， respectively. Correlation anaysis of three relaxation parameters and meat quality indices was conducted by measuring pearson correlation coefficients. Our results showed that the correlations between the studied relaxation parameters and meat quality indices were strong in non-vacuum packaged beef but not strong in acuum packaged beef. Free water had the biggest influce on meat quality during controlled freezing point storage of beef. The relaxation parameter of free water may hold great promise for potential applications to study quality indices of non-vacuum packaged beef.

Key words：ice-temperature storage；vacuum package；low-field nuclear magnetic resonance；beef；moisture state

中圖分類號：TS251.51；TS207.3 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）05-0017-05

采購新鮮牛肉作為烹飪食材構(gòu)成了國民消費牛肉的主要方式，新鮮牛肉的貯藏和流通多采用冷藏手段，普通0～4℃的貯藏溫度并不能完全滿足對牛肉保鮮的的需要。而將生鮮食品置于0℃以下，食品冰點以上的溫度范圍內(nèi)保藏的冰溫貯藏技術(shù)是繼冷藏和氣調(diào)貯藏之后的第3代保鮮技術(shù)，將牛肉置于這個溫度范圍內(nèi)時，其生理活性維持在最低程度，但又能保持正常的生化變化。并且肉始終處于不凍結(jié)的鮮活狀態(tài)，不會對肉產(chǎn)生凍害，故能達到長期保鮮的效果[1-4]。

牛肉中主要成分是水、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和其他一些可溶性物質(zhì)，其中水的含量可占到70%～80%[5-6]。牛肉在儲藏期間發(fā)生的許多理化變化都與牛肉內(nèi)部水分的活動狀態(tài)及遷移情況有關(guān)。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）可以通過檢測肉中氫質(zhì)子的弛豫時間來獲得肉貯藏過程水分的狀態(tài)、不同狀態(tài)水分的含量及變化過程等信息[7-8]。

目前，我國對牛肉品質(zhì)指標(biāo)的檢測仍為傳統(tǒng)方法，缺點在于費時費力，不易進行大批量的快速檢測[9]，而核磁共振技術(shù)具有檢測迅速、樣品需要量少、無需前處理且對樣品無損等優(yōu)點[7]。本實驗利用低場核磁共振技術(shù)研究了冰溫貯藏條件下無包裝（no packing，NP）的牛肉與真空包裝（vacuum packing，VP）的牛肉在貯藏過程中不同活動狀態(tài)水分的變化規(guī)律，并與常見的肉品品質(zhì)指標(biāo)進行了皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析，研究了兩者間的相關(guān)性，確定對冰溫貯藏牛肉的品質(zhì)影響最大的水分，為牛肉品質(zhì)檢測提供一種快速、無損的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮牛肉：屠宰12h內(nèi)的鮮牛霖肉 市購；鹽酸、稀硫酸、碳酸鉀、硼酸、甘油、阿拉伯膠、甲基紅、次甲基藍、乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NMI20-Analyst核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；數(shù)顯溫度計 天津市科輝儀表廠；JY3001型電子天平、JA-1104N型電子天平（感應(yīng)量為0.0001g） 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；pH100型筆式pH計 上海三信儀表廠；C-LM3型數(shù)顯式肌肉嫩度儀由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院研制；雙夾板壓力計 實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 肉樣處理

購買屠宰12h內(nèi)的冷鮮牛霖肉，采用內(nèi)裝冰袋的保溫包4℃運回，去除附著的脂肪和結(jié)締組織，平均分割成小份，將肉置于溫度為-1℃（冰溫）冰箱變溫區(qū)貯藏（冰箱內(nèi)相對濕度70%）。各項指標(biāo)每2d測定1次。

1.3.2 冰點測定

將數(shù)顯溫度計的電極插入5cm×5cm×5cm的牛肉塊體積中心，置于-15℃冷庫中，每分鐘記錄溫度，作牛肉中心溫度隨凍結(jié)時間變化的曲線，當(dāng)溫度下降到0℃以下出現(xiàn)輕微回升，而后變化緩慢或停止，以此時的溫度為牛肉的冰點溫度[10]。

1.3.3 核磁共振測定

每次測定時，一塊肉取3份樣品，每份樣品均準(zhǔn)確稱質(zhì)量1g，肉樣無需進行前處理，只需切成適宜大小，用玻棒輕輕塞入核磁共振專用試管，盡量排除肉樣間隙中的空氣，切勿用力擠壓肉，避免擠出肉中水分，影響實驗結(jié)果。

核磁共振測定在紐邁核磁共振成像分析儀上進行，測定過程中為保證實驗的平行性和結(jié)果的可靠性，每次測定均固定在相同時間段。并且確保40min內(nèi)完成樣品制備和測定，以免肉樣過久曝露在空氣中失水，影響實驗結(jié)果。

測定樣品橫向弛豫時間（T2）步驟：1）測定時，開啟電腦，將樣品管放入儀器磁體箱中，打開核磁共振分析軟件（上海紐邁電子科技有限公司提供的Analyst Software Ver3.3），開啟射頻單元電源（儀器工作溫度32℃）。2）在參數(shù)設(shè)置中選擇硬脈沖序列（Hard Pulse FID），尋找中心頻率SF1+O1（肉中氫質(zhì)子的共振頻率）。3）進入硬脈沖CPMG 序列設(shè)置參數(shù)：TD =100050，SW=100kHz，D3=80μs，TR=1000ms，RG1=20，RG2=3，NS=4，EchoTime=500.00μs，EchoCount=1000，開始檢測。4）檢測結(jié)束保存數(shù)據(jù)，進入反演軟件（上海紐邁電子科技有限公司提供的核磁共振弛豫時間反演擬合軟件Ver4.09）反演出T2的分布情況。

1.3.4 pH值測定

用pH100型筆式pH計直接測定肉新鮮切面的pH值，依次取3個測試點。

1.3.5 失水率[11]

將肉樣切為1.0mm厚度，用直徑2.523cm圓形取樣器切取肉樣，用感量為0.0001g天平稱質(zhì)量，然后將肉樣上下各墊6層濾紙，置于35kg壓力計上壓制5min，撤除壓力后立即稱質(zhì)量。

失水率/%=×100

1.3.6 數(shù)據(jù)分析方法

對采集的試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行相關(guān)性和方差分析，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉肉冰點測定

圖1為牛肉凍結(jié)過程中心溫度隨凍結(jié)時間變化的曲線，在溫度下降到-1.1～-1.2℃后，進入最大冰晶生成帶，溫度變化開始停止，因此確定-1.2℃為其初始冰點，故將冰溫貯藏的溫度定為-1℃。

圖 1 牛肉中心溫度變化曲線

Fig.1 Changes in internal temperature during controlled freezing point storage of beef

2.2 冷鮮牛肉的核磁共振弛豫參數(shù)

NMR用于肉品水分研究時主要采用的是橫向弛豫時間（T2），這是由于T2變化范圍較大，與T1相比對多相態(tài)的存在更敏感[7]。圖2是由核磁共振反演軟件作出的新鮮牛肉橫向馳豫時間（T2）譜圖，圖中形成幾個峰，則可說明牛肉中有幾種活動狀態(tài)的水分[12]。譜圖中各個峰點所對應(yīng)的橫坐標(biāo)位置就是該種水分的平均T2值，T2值越低表明該種水分與底物結(jié)合越緊密，T2值越大說明水分越自由[13-14]。由圖2可看出新鮮牛肉中有3種不同活動狀態(tài)的水：結(jié)合水、不易流動水和自由水，用T21（0～10ms）、T22（10～100ms）、T23（100～1000ms）分別對應(yīng)[15]。

圖 2 新鮮牛肉橫向弛豫時間（T2）譜圖

Fig.2 The transverse relaxation time （T2） of fresh beef

牛肉貯藏期間冰箱內(nèi)相對濕度為70%。從表1可以看出，在整個貯藏期間，隨著貯藏時間的增加，無包裝和真空包裝牛肉的T21值無顯著變化（P>0.05），平均值在2～5ms之間。兩種包裝牛肉的T22值均穩(wěn)定在49ms左右無變化，說明隨著貯藏時間的延長，牛肉中結(jié)合水和不易流動水與底物的結(jié)合程度改變很小或沒有改變。

兩種包裝牛肉的T23值均差異顯著（P<0.05），其中無包裝的牛肉T23值1～9d隨貯藏時間的延長顯著上升（P<0.05），之后9～11d顯著下降（P<0.05），11～17d變化不顯著（P>0.05），之后開始顯著下降，從第19天開始，在100～1000ms的范圍內(nèi)已經(jīng)沒有峰，T23消失。說明無包裝的牛肉在貯藏前期，肉中自由水的移動性越來越強，即越來越自由。后期自由水的移動性開始慢慢下降直至完全消失。真空包裝的牛肉的T23在整個貯藏期內(nèi)一直存在，T23值的組間變化顯著（P<0.05），但規(guī)律性不強。

表 1 牛肉T2隨貯藏時間變化趨勢

Table 1 Temporal evolution of T2 during controlled freezing point storage of beef

貯藏時間/d NP VP

T21/ms T22/ms T23/ms T21/ms T22/ms T23/ms

1 3.49±0.87ab 49.77±0a 175.89±24.49bc 3.49±0.87a 49.77±0a 175.89±24.49d

3 3.03±1.014ab 49.77±0a 192.20±15.11bc 2.61±.079a 49.77±0a 220.98±17.37ab

5 2.96±0.61ab 49.77±0a 200.92±0abc 3.34±0.89a 49.77±0a 192.20±15.11bcd

7 2.96±0.60ab 49.77±0a 200.92±0abc 3.20±0.25a 49.77±0a 174.75±0d

9 3.16±0.69ab 49.77±0a 220.98±17.37a 2.56±0.43a 49.77±0a 231.01±0a

11 2.26±0.78b 49.77±0a 192.20±15.11bc 3.07±0.43a 49.77±0a 167.17±13.14d

13 3.66±1.21ab 49.77±0a 200.92±0abc 4.44±0.35a 49.77±0a 212.26±32.48abc

15 3.68±1.25ab 49.77±0a 202.23±28.15ab 3.43±1.06a 49.77±0a 231.01±0a

17 2.71±0.69ab 49.77±0a 174.75±0c 4.10±0.70a 49.77±0a 192.20±15.11bcd

19 2.75±0.56ab 49.77±0a — 3.25±0.71a 49.77±0a 210.95±17.37abc

21 4.74±1.21a 49.77±0a — 4.21±1.39a 49.77±0a 183.48±15.11cd

注：不同上標(biāo)字母表示同列數(shù)據(jù)間差異顯著（P<0.05），下同?！? 表示無包裝牛肉第19天開始T23消失，無此值。

核磁共振反演軟件可自動求得譜圖上每個峰的峰面積及總峰面積，由峰面積可估算出肉中不同狀態(tài)水分及總水分的含量[15]。由無包裝和真空包裝的牛肉T2峰面積隨貯藏時間的變化趨勢（表2）可知，兩種包裝牛肉中T21、T22和T23峰面積隨貯藏時間的變化均顯著（P<0.05）。無包裝牛肉的總峰面積變化顯著（P<0.05）和真空包裝牛肉的總峰面積變化不顯著（P>0.05）。

無包裝牛肉的T23峰面積在貯藏期間總體變化趨勢為先上升后下降，峰面積從第1天的31.35±5.89到第9天達到最大的64.40±9.77，之后顯著下降（P<0.05），從第19天開始T23消失，峰面積降為0，表示牛肉中自由水消失，并且總峰面積顯著下降，表現(xiàn)在感官上就是無包裝的牛肉在貯藏后期失水變得干硬。

而真空包裝牛肉的T23峰面積在貯藏期間變化趨勢為先上升再下降最后上升，峰面積在第11天時為最小的12.10±3.31，之后慢慢上升，到第21天時為29.20±3.90，基本接近第1天的值。真空包裝牛肉總峰面積在貯藏期內(nèi)變化不顯著，表示真空包裝牛肉中總水分含量變化不大。

2.2 冷鮮牛肉品質(zhì)指標(biāo)變化

如表3所示，牛肉貯藏過程中，兩種包裝牛肉的pH值開始均會下降，當(dāng)下降到一定程度后，又會逐漸升高。牛肉pH值的這一變化規(guī)律是由于家畜宰后肌肉中代謝過程發(fā)生改變，肌糖原無氧酵解，產(chǎn)生乳酸，三磷酸腺苷（ATP）迅速分解，使肉pH值下降。肉腐敗時，由于肉內(nèi)蛋白質(zhì)在細(xì)菌酶的作用下，被分解為氨和胺類化合物等堿性物質(zhì)，因而使肉趨于堿性，pH值顯著增高[16-18]。無包裝與真空包裝牛肉的pH值在前7d隨貯藏時間的延長顯著下降（P<0.05），最低pH值均出現(xiàn)在第7天，分別為4.88±0.02和4.95±0.01，第7天開始至第21天總體趨勢顯著升高（P<0.05）。貯藏期間真空包裝牛肉的pH值一直維持在較低水平，pH值在4.98～5.81之間。肉類pH值在5.45～5.60之間時能保持較好的品質(zhì)[19]。故可推斷冰溫結(jié)合真空包裝對牛肉的保鮮效果良好。

表 3 牛肉pH值及失水率隨貯藏時間的變化

Table 3 Temporal evolution of pH and drip loss during controlled freezing point storage of beef

貯藏

時間/d NP VP

pH 失水率/% pH 失水率/%

1 5.81±0.05d 32.90±1.03cd 5.81±0.05a 32.90±1.04def

3 4.95±0.02e 34.22±1.78bcd 5.14±0.02e 33.17±0.79cdef

5 4.96±0.04e 33.48±1.70cd 4.98±0.01h 35.64±1.32bcd

7 4.88±0.02f 35.73±0.03bc 4.95±0.01h 35.82±1.56bc

9 4.94±0.01e 40.13±1.64a 5.12±0.02e 32.46±1.43ef

11 4.94±0.02e 37.19±1.35abc 5.26±0.03d 31.28±1.72f

13 4.96±0.01e 38.07±1.51ab 5.05±0.01f 34.74±1.05bcde

15 5.8±0.04d 35.2±1.21bc 5.14±0.01e 35.47±0.27bcd

17 6.09±0.04c 34.69±0.69bcd 5.26±0.01d 36.88±0.37b

19 6.37±0.02b 30.56±0.65d 5.31±0.01c 36.92±0.90b

21 6.62±0.03a 26.39±1.23e 5.52±0.02b 40.28±1.29a

肉的失水率越高，表明肌肉系水力越低。牛肉貯藏過程中，失水率存在先升高，然后再下降的趨勢。這一變化趨勢主要是由于宰后肌肉的pH值變化直接影響肌肉的系水力。pH值下降，時肌肉蛋白質(zhì)的靜電荷強度減弱，使電荷間的相互作用力減弱，肌球蛋白纖絲和肌動蛋白纖絲之間的間隙縮小，肉的保水性能降低，失水率升高。發(fā)生僵直時，肌球蛋白和肌動蛋白形成肌動球蛋白復(fù)合體而使肌肉系水力變得最低，失水率達到最大。之后的成熟過程中，蛋白質(zhì)和鈣、鎂陽離子結(jié)合，肌原纖維的蛋白質(zhì)自由電荷逐漸增加，系水力會有所提高。當(dāng)pH值大于或小于蛋白質(zhì)的等電點時。由于蛋白質(zhì)的兩性解離作用，肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)松弛，水分子在親水基團的作用下，貯留于肌原纖維蛋白質(zhì)分子問，系水力提高，失水率下降[16]。由表3可知，無包裝牛肉的失水率前9d隨貯藏時間延長顯著升高（P<0.05），從第9天開始到第21天顯著下降（P<0.05）。真空包裝牛肉的失水率變化呈現(xiàn)的趨勢為前7d先顯著升高（P<0.05），7～11d顯著下降（P<0.05），最后11～21d再顯著升高（P<0.05）?？赡芘c外加真空包裝會對牛肉組織產(chǎn)生壓力，影響牛肉保水性有關(guān)。

值得指出的是無包裝牛肉的失水率在第9天時達到最大的（40.13±1.64）%，而牛肉T23峰面積亦達到最高。真空包裝的牛肉的失水率在第11天時最小，為（31.28±1.72）%，此時真空包裝牛肉T23峰面積也為最小?？梢酝茢嗯Ｈ庀邓εc牛肉中的自由水含量密切相關(guān)。

2.3 弛豫參數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

利用SPSS 17.0軟件對對NMR弛豫參數(shù)與各項理化指標(biāo)進行Pearson相關(guān)系數(shù)分析。相關(guān)系數(shù)（R）的值在-1～1之間（負(fù)號代表兩個變量呈負(fù)相關(guān)），一般當(dāng)0.8≤R≤1 或-1≤R≤-0.8 時，說明兩變量之間具有很強的相關(guān)性；當(dāng)R值介于0.5～0.8或-0.8～-0.5之間時，說明兩變量之間具有一般的相關(guān)性；當(dāng)-0.5≤R≤0.5時，說明兩變量之間之間相關(guān)性較弱[20]。

本實驗相關(guān)性分析的結(jié)果如表4所示：無包裝牛肉T23值與其pH值、失水率均有較強的相關(guān)性，T23峰面積與其pH值有較強的相關(guān)性，與其失水率相關(guān)性一般。無包裝牛肉的其余弛豫參數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性均較弱；真空包裝牛肉T22峰面積與其失水率的相關(guān)性較強，而其余弛豫參數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性均不強。

并且無包裝牛肉T23峰面積的變化規(guī)律與牛肉宰后的尸僵與成熟過程密切相關(guān)有關(guān)，牛肉屠宰后，會先進入僵直期。發(fā)生僵直時，肌肉保水性變得最低[16]，此時牛肉對水分的束縛能力最弱，水分逐步轉(zhuǎn)變成與底物結(jié)合程度較低的自由水。與此對應(yīng)，無包裝的牛肉在第9天時失水率與自由水的峰面積均達到最大，可以推斷牛肉在此時間段達到最大僵直。常溫下牛肉僵直一般發(fā)生在宰后12h以后，低溫會導(dǎo)致僵直延遲，0～4℃情況下僵直的完成需一周左右的時間[21]。說明冰溫貯藏有效延遲了牛肉的僵直、解僵過程。該條件下貯藏牛肉，能較長時間使牛肉保持在較好的品質(zhì)范圍內(nèi)。

牛肉在達到最大僵直后進入解僵期，肉中繼續(xù)發(fā)生著一系列生物化學(xué)變化進入后熟期，保水性能恢復(fù)，肌肉變的柔軟多汁[16]。按此規(guī)律，此時肉中自由水含量應(yīng)當(dāng)增加，而事實上是從第9天開始，無包裝的牛肉自由水開始減少，可能與牛肉長時間無包裝貯藏導(dǎo)致失水有關(guān)。

而真空包裝的牛肉自由水含量變化規(guī)律之所以與無包裝的牛肉不同，是由于真空包裝導(dǎo)致牛肉中水分難以揮發(fā)，這點可由真空包裝牛肉的總水分含量在貯藏期內(nèi)變化不顯著得知。并且真空包裝加大了牛肉組織間的壓力，影響了牛肉的保水性。

3 結(jié) 論

低場核磁共振技術(shù)能夠很好地表征冰溫貯藏條件下牛肉中不同形式的水分含量及分布情況。無包裝牛肉自由水弛豫參數(shù)與其pH值、失水率均有較強的相關(guān)性，而結(jié)合水與不易流動水的弛豫參數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性則較弱；真空包裝牛肉的弛豫參數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性均不強。

由本研究可知，對冰溫貯藏牛肉的品質(zhì)影響最大的水分是自由水，自由水的弛豫參數(shù)能夠很好的用于無包裝牛肉常規(guī)品質(zhì)指標(biāo)的研究。

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