湛劍龍 陳韻 黃林波等
摘要:采用傳統(tǒng)微生物分離方法進行乳酸菌純種分離,利用16S rRNA序列分析方法進行乳酸菌鑒定,從7個酸肉、酸魚樣品中共分離出14株乳酸菌,有乳桿菌屬、環(huán)絲菌屬、乳球菌屬3個屬,9個種。從其中鑒定出7株乳酸菌,分別是:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)、泡菜乳桿菌(Lactobacillus kimchi)、清酒乳桿菌亞種(肉)(Lactobacillus sakei subsp. carnosus)、草乳桿菌(Lactobacillus graminis)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)。
關鍵詞:酸魚;酸肉;乳酸菌;分離鑒定
中圖分類號:TS214.2 文獻標志碼:A 文章編號:1001-8123(2013)07-0040-04
貴州黔東南苗族、侗族自治州傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉/魚制品主要是以豬肉和魚肉為原料,洗凈后加入一定量的鹽腌制2~3d,再根據(jù)當?shù)氐娘嬍沉晳T多加甜酒、熟糯米、生姜、花椒、辣椒粉、大蒜等輔料,裝入壇、瓦缸、木桶等容器中,上層用葉片、塑料和水來隔絕空氣,放置于避光陰涼地方自然發(fā)酵。此方法是當?shù)鼐用裱永m(xù)祖先智慧結晶一代一代傳承下來的,具有歷史悠久、風味獨特、安全和綠色的特點。但由于傳統(tǒng)手工工藝制作,發(fā)酵時間長,沒有大規(guī)模的生產(chǎn)和市場上流通,其他地域的人們無法享受這種風味獨特的發(fā)酵肉制品[1-3]。乳酸菌是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢菌群,對發(fā)酵產(chǎn)品的風味和營養(yǎng)品質(zhì)變化起著至關重要的作用[4-7]。目前,對于貴州傳統(tǒng)少數(shù)民族發(fā)酵肉制品中乳酸菌的研究還相當缺乏[8]。因此,本研究以貴州少數(shù)民族地區(qū)侗族發(fā)酵酸肉和苗族發(fā)酵酸魚為材料,采用傳統(tǒng)微生物分離方法進行乳酸菌純種分離,利用16S rRNA序列分析方法進行乳酸菌鑒定[9-12],旨在從原生態(tài)食品中發(fā)掘有益乳酸菌,以利于進一步研究乳酸菌的發(fā)酵特性、改進傳統(tǒng)工藝,為保護、利用本土原生態(tài)的微生物資源打下基礎。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 實驗材料
實驗原料來自于貴州省黔東南州從江縣及黎平縣農(nóng)戶家純手工制作的酸肉、酸魚,共7個樣品,其中酸肉4個樣品,酸魚3個樣品,采樣時嚴格按照國標GB/T4789.1—2010《食品安全國家標準:食品微生物學檢驗》操作。酸肉、酸魚樣品分別編號如表1所示。
1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑
培養(yǎng)基:MRS肉湯培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、PYG液體培養(yǎng)基(在PY培養(yǎng)基中添加10g/L葡萄糖)。
主要試劑:革蘭氏染色試劑、細菌微量生化鑒定管(麥芽糖、乳糖、葡萄糖)、試劑A(α-萘酚5g和95%體積分數(shù)乙醇100mL)、試劑B(KOH 80g、肌酸(Creatine)0.6g、蒸餾水200mL)、溶菌酶、CTAB(十六烷基三甲溴化胺)裂解液、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、聚乙二醇均為分析純。
1.2 儀器與設備
CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司;S1000TM Thermal Cycler PCR儀、DcodeTM Universal Mutation Detection System DGGE電泳儀、Gel DocXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;Gilson P型移液器 法國吉爾森公司;Micro 17R微量高速冷凍離心機 美國Thermo Electron公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株分離純化
取3g樣品,剪碎放入MRS液體培養(yǎng)基中, 36℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h,然后稀釋5個梯度(10-1~10-5)后,直接涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,36℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h。再采用平板劃線法對涂布平板中不同的單個菌落進行接種、培養(yǎng),并進行革蘭氏染色和鏡檢,重復分離純化直至鏡檢結果一致。
1.3.2 菌株分類鑒定方法
1.3.2.1 菌落特征
對純化菌株在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落特征進行觀察、記錄和編號,主要包括菌落大小、形狀、顏色、濕潤度、光澤度、透明度、隆起形狀、邊緣特征等。將初步認定為乳酸菌菌株進行革蘭氏染色鏡檢。
1.3.2.2 菌種分類生理生化試驗
主要生理生化試驗包括:接觸酶試驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇(voges-proskauer,VP)試驗、石蕊牛奶試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖產(chǎn)酸試驗和糖發(fā)酵試驗[13-15]。
1.3.3 菌株DNA的提取
參照譚映月等[16]提取DNA方法,有所改動。取備用菌株菌液2mL于2mL離心管中,8000×g離心8min,收集沉淀;加200μL溶菌酶(質(zhì)量濃度為0.05g/mL),置于35℃水浴2h;加2%十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)裂解液0.5mL,上下顛倒混勻10min;加0.5mL Tris-飽和酚:氯仿:異戊醇=25:24:1,上下顛倒混勻2min后,于10000×g離心5min;收集上清液轉(zhuǎn)入新的離心管,加入等體積的氯仿:異戊醇=24:1,上下顛倒混勻2min后于10000×g離心5min;收集上清液轉(zhuǎn)入新的離心管,加入2倍體積30%聚乙二醇于4℃條件下沉淀4h;取出離心管于14000×g離心8min,倒掉上清液,用70%體積分數(shù)乙醇洗滌DNA 3次,經(jīng)真空干燥后轉(zhuǎn)入0.2mL PCR管,加50mL TE(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)緩沖液于―20℃保存。
1.3.4 PCR擴增細菌16S rRNA全長[17]
采用細菌通用引物:27F:5'- AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3';1492R:5'- GGTTACCTTG TTACGACTT-3'。
25μL反應體系:1μL模板DNA,引物(1μmol/L)各2.5μL,Go Taq Green Master Mix(2×)12.5μL,去離子水6.5μL。反應程序:95℃預變性2min;25個循環(huán)包括:94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸2min;最終72℃延伸2min。用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。
1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法
取PCR擴增產(chǎn)物送上海生工公司進行測序分析,在ABI DNA自動測序儀上進行測序反應。登陸NCBI網(wǎng)站,與已知基因序列進行比對。
2 結果與分析
2.1 菌株的分離
對來自貴州黔東南苗族、侗族自治州的發(fā)酵酸肉、酸魚7個樣品中的優(yōu)勢乳酸菌群進行分離及純化,共得到14株純菌株。從SR1中分離出2株,SR2中分離出1株,SR3中分離出3株,SR4中分離出2株;從SY1中分離出1株,SY2中分離出2株,SY3中分離出3株。從SR2只分離出1株乳酸菌,由于酸肉發(fā)酵時間超過1年,其中的優(yōu)勢乳酸菌群已經(jīng)十分穩(wěn)定,其他菌群在發(fā)酵過程中處于競爭劣勢,隨著時間的延長逐步消亡;SR3中分離出3株,是酸肉樣品中發(fā)酵時間最短的,僅3個月,也是分離出優(yōu)勢乳酸菌最多的。
2.2 菌株分類鑒定
2.2.1 形態(tài)學觀察
將14株菌接種于MRS固體培養(yǎng)基上,置于37℃培養(yǎng)24h后鏡檢觀察,菌落形態(tài)特征如表2所示。
2.2.2 生理生化試驗
14株菌進行的生理生化試驗結果如表3所示。試驗結果表明:14株菌株均能使石蕊牛奶變?yōu)榉奂t色,表明14株菌均能在石蕊牛奶中產(chǎn)酸;14株菌均能是使粉紅色的石蕊牛奶凝固,表明14株菌產(chǎn)酸能力很強;只有SR2、SR3-1、SR3-2、SR4-1這4株菌能使牛奶清澈,表明只有它們能產(chǎn)蛋白酶。所有14株菌過氧化氫酶全部為陰性,乙酰甲基甲醇試驗、甲基紅試驗全部為陽性,淀粉水解試驗中,除SR1-1、SR1-2為陰性外,其余菌全部能水解淀粉。糖發(fā)酵試驗表明:14株菌培養(yǎng)24h后均能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸使細菌微量生化鑒定管中葡萄糖培養(yǎng)液變?yōu)辄S色,呈陽性。除SR2和SR3-1未能完全發(fā)酵麥芽糖,導致管內(nèi)為半黃半紫;其余12株菌均能使均能發(fā)酵麥芽糖使培養(yǎng)液變?yōu)辄S色,呈陽性;在乳糖發(fā)酵中,SR1-1、SR1-2和SR2未能發(fā)酵乳糖,顏色仍為藍紫色,呈陰性,SR3-1、SR3-2、SY2-1、SY2-2和SY3-3不完全發(fā)酵乳糖,使管中乳糖培養(yǎng)液為半黃半紫;SR3-3、SR4-1、SR4-2、SY1、SY3-1和SY3-2均能發(fā)酵乳糖,使管內(nèi)乳糖培養(yǎng)液完全變?yōu)辄S色,呈陽性。
2.2.3 菌株擬鑒定結果
參考《常見細菌鑒定手冊》[18]及《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[19]對14株菌進行形態(tài)學特征和生理生化試驗分類鑒定,由菌落形態(tài)、革蘭氏染色、接觸酶試驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇試驗、石蕊牛奶試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖產(chǎn)酸試驗、麥芽糖和乳糖發(fā)酵試驗等結果表明,14株細菌均為乳酸菌,并確定有乳桿菌屬、環(huán)絲菌屬、乳球菌屬3個屬。
2.3 DNA測序結果及分析
2.3.1 DNA提取結果檢測
選取7株乳酸菌提取的DNA經(jīng)瓊脂糖電泳后的凝膠于凝膠成像如圖1所示。采用溶菌酶消化裂解法提取的DNA條帶清晰,主帶明顯,不過此法所提DNA出現(xiàn)拖尾,分析原因可能是提取過程中DNA條帶被打斷或者是RNA干擾所致。
2.3.2 PCR擴增結果
7株菌DNA經(jīng)正反2種引物擴增各樣品的16S rRNA 如圖2所示,全長效果均良好,條帶清晰。
2.3.3 測序結果
7株菌16S rRNA序列與美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫與已知細菌基因序列進行比對,結果見表4。
從表4鑒定結果可知,所鑒定7株細菌全部為乳酸菌,與NCBI數(shù)據(jù)庫已知菌株序列的相似性達99%。SR2號菌鑒定為泡菜乳桿菌(Lactobacillus kimchi),SR3-1號菌為消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius),SR3-3號菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),SR4-1號菌為草乳桿菌(Lactobacillus graminis),SR4-2號菌為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),SY3-1號菌為清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei),SY3-3號菌為清酒亞種(Lactobacillus sakei subsp. carnosus)。其中植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和清酒乳桿菌亞種4株菌的分離鑒定、益生特性及在發(fā)酵肉質(zhì)品中的作用均有研究,而消化乳桿菌、草乳桿菌、泡菜乳桿菌[20]的相關研究報道很少。
3 結 論
傳統(tǒng)酸肉和酸魚中乳酸菌群在發(fā)酵過程中隨著時間延長,優(yōu)勢乳酸菌群種類逐漸減少,最終趨近穩(wěn)定,一般優(yōu)勢乳酸菌群只有1~2種;由于地域不同,制作工藝有差異,酸肉和酸魚中優(yōu)勢乳酸菌群也不相同。本研究從7份樣品酸肉/魚中,共分離出乳酸菌14株,目前鑒定出7株乳酸菌,分別是:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)、泡菜乳桿菌(Lactobacillus kimchi)、清酒亞種(Lactobacillus sakei subsp. carnosus)、草乳桿菌(Lactobacillus graminis)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)。本實驗分離鑒定出酸肉、酸魚中的乳酸菌有利于了解其中的乳酸菌群,為揭示酸肉、酸魚發(fā)酵機理,擴大市場,發(fā)掘其中的益生乳酸菌打下基礎。
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