薛寶玲　王水清　張冬梅等

摘要：采用不同月齡的烏珠穆沁羊骨骼肌中的股二頭肌，采取組織化學(xué)染色法對肌纖維類型的變化進(jìn)行研究，了解肉羊生長過程中肌纖維類型的變化規(guī)律。骨骼肌用多聚甲醛固定液固定、切薄片。在酸性和堿性孵育液中孵育后，巴比妥鈉溶液中沖洗后硫化銨液中孵育。用乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，隨著月齡的增加，股二頭肌中Ⅱa型肌纖維百分含量在3、6月齡及12、18月齡之間差異不顯著（P>0.05），百分含量在12月齡時最高。Ⅱb型肌纖維的百分比在18月齡最高。I型纖維在18月齡時含量最低。

關(guān)鍵詞：烏珠穆沁羊；骨骼?。患±w維類型；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳

中圖分類號：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）07-0010-04

肌細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，呈長線狀，也稱為肌纖維[1]。肌纖維是構(gòu)成肌肉的基本單位，骨骼肌的質(zhì)量占動物總體質(zhì)量的40%～50%，是機體的主要代謝器官，也是畜牧業(yè)生產(chǎn)中主要的動物產(chǎn)品[2]。劃分肌纖維類型有許多方法，肌肉由不同類型的肌纖維組成。根據(jù)顏色、收縮特性可將肌纖維分成慢紅肌纖維、快紅肌纖維和快白肌纖維[3]。Brooke等[4]將肌纖維分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb 3種類型，在代謝上分別是慢型、快型、中間型。不同肌纖維類型具有不同的特性，并直接影響肌肉的品質(zhì)[5]。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維的類型組成對肉羊宰后品質(zhì)、外觀、生理、生化等特性有重要影響[6]。川井田博[7]和楊曉靜等[8]研究表明，肌肉中肌纖維的直徑度和單位面積的同種肌纖維數(shù)量是影響肉的嫩度和持水性的重要指標(biāo)之一，肌纖維越粗，單位面積的同種肌纖維數(shù)量越少，肉品質(zhì)越粗糙。Ashmore等[9]指出肌纖維的類型、差異及其生化和組化特性與肉質(zhì)表觀性狀的關(guān)系及未來育種戰(zhàn)略中提高家畜肉產(chǎn)量和改善肉品質(zhì)密切相關(guān)。Iteggin等[10]研究表明肌肉中肌纖維類型的組成是通過影響動物尸僵前后肌肉中的一系列生物化學(xué)變化過程而影響肉品質(zhì)的。

烏珠穆沁羊是蒙古羊系統(tǒng)中自然放牧條件下的優(yōu)良品種[11]。目前對烏珠穆沁羊的遺傳培育、圈養(yǎng)以及宰后肉品質(zhì)、肉的成熟等方面的研究很多[12]。本實驗對不同生長階段烏珠穆沁羊的骨骼肌肌纖維類型的變化特性進(jìn)行研究，旨在了解不同月齡的生長階段肌纖維類型的變化規(guī)律，對于提高家畜肉品質(zhì)和改善畜產(chǎn)品加工提供可靠參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取自然放牧環(huán)境下的1、3、6、9、12、18月齡的烏珠穆沁羊，同一個羊群中各月齡分別取3只。屠宰后取其股二頭肌，將樣品分裝，裝入凍存管中直接投入液氮中速凍，放-80℃冰箱保存。

二甲苯、甘油、Tris、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA） 南京市新源化工有限公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇 生工生物工程（上海）股份有限公司；巴比妥鈉 上海紫一試劑廠；無水乙醇、乙酸鈉 天津市綠源生態(tài)能源有限公司；氯化鈷 鄭州天邦化工有限公司；硫化銨 上海至鑫化工有限公司；鹽酸 山東三方化工集團；四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS） 上海葉舟生物科技有限公司；溴酸藍(lán)、考馬斯亮藍(lán) G-250 沈陽市新光化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10型pH計 北京賽多利斯科學(xué)儀器公司；平衡補風(fēng)型通風(fēng)柜 北京世安科興科技開發(fā)有限責(zé)任公司；DSH-300A型回旋式恒溫水浴振蕩器 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；Tissue-Tek衡冷凍切片機 德國SLEE公司；CX31光學(xué)顯微鏡 日本Olympus光學(xué)株式會社；Arium 61316超純水器 北京賽多利斯儀器廠；85-2型磁力攪拌器 北京國華科技有限公司；BG-power 600通用電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品冷凍切片處理

將樣品從-80℃冰箱取出，-20℃環(huán)境下靜置30min～1h，迅速修成1.5cm×1.5cm×1.5cm的小塊，在恒溫冷凍切片機上-20℃切片，厚為12μm，立即粘貼于準(zhǔn)備好的載玻片的正面，室溫條件下干燥完全即可進(jìn)行染色。

1.3.2 組織化學(xué)染色

采用Schiaffino等[13]的腺苷三磷酸酶（ATPase）染色法。將干燥完全的切片于多聚甲醛固定液中固定，蒸餾水沖洗后置酸性和堿性孵育液中孵育，巴比妥鈉溶液沖洗，硫化銨溶液靜置，常規(guī)梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.3 肌球蛋白的提取

參考Light等[14]的方法。取去掉脂肪和大塊的結(jié)締組織的肌肉組織，切碎，再次去掉較細(xì)的結(jié)締組織，加入勻漿液進(jìn)行勻漿處理，冰上靜置，超高速離心，分注上清液，放入-20℃保存。

1.3.4 SDS-PAGE電泳分離肌球蛋白重鎖異構(gòu)體

參考Light等[14]的方法進(jìn)行分離。分離膠混勻后迅速注入兩塊凝膠板中，輕點少量蒸餾水，不要讓凝膠板移動，傾斜模具見凝膠成斜直線，用濾紙吸干上面的蒸餾水。濃縮膠注在分離膠之上，插進(jìn)電泳梳子，4℃凝膠。凝好后緩慢拔出，放置于電泳槽中，下槽注入電泳緩沖液（lower buffer），上槽中注入電極緩沖液（upper buffer）。將樣品按月齡順序注入膠孔。進(jìn)行電泳，至凝膠板中的藍(lán)紫色線離下端1.5cm處停止電泳。取下凝膠板4℃染色、4℃脫色，直至條帶清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨骼肌肌纖維類型分布

A. 1月齡

B. 3月齡

C. 6月齡

D. 9月齡

E. 12月齡

F. 18月齡

圖1是經(jīng)ATPsae染色后，不同月齡生長階段烏珠穆沁羊中股二頭肌肌纖維類型的分類圖像。如圖1中箭頭所指：黑色（最深色）的是Ⅰ型，白色（淺色）的是Ⅱa型，棕色（中間色）是Ⅱb型。

由表1可知，股二頭肌中Ⅰ型肌纖維在1、3、6、9月齡有逐漸降低趨勢，12月齡時百分含量增加，9、18月齡時百分含量較低，除了6、12月齡外其他月齡之間差異均顯著（P<0.05）。Ⅱa型肌纖維百分含量在3、6月齡及12、18月齡之間差異不顯著（P>0.05）。Ⅱb型肌纖維百分含量在1、3、6月齡顯著上升（P<0.05），6月齡和9月齡差異不顯著（P>0.05），9、12、18月齡之間差異均顯著（P<0.05），百分含量在18月齡達(dá)到最高。

2.2 骨骼肌中肌球蛋白重鎖異構(gòu)體

肌球蛋白重鎖異構(gòu)體通常能夠確定肌纖維的類型[15]。之所以能將肌球蛋白中的重鎖異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分是由于其在電泳凝膠中的移動速率不同[16]。圖2是對烏珠穆沁羊不同月齡股二頭肌中肌球蛋白提取并進(jìn)行SDS-PAGE電泳圖，從圖2可以看到比較明顯的條帶分別為I型、Ⅱb型與Ⅱa型。這一結(jié)果與ATPase染色結(jié)果相一致，說明在股二頭肌中確實存在這三種類型的肌纖維。

動物在生長過程中，受不同品種、月份變化、外界條件、飼養(yǎng)條件、肌肉分布等因素的影響，骨骼肌中不同肌纖維類型能夠相互轉(zhuǎn)化[17]。剛出生后的動物白肌較少，在生長過程中紅肌纖維數(shù)量逐漸增多，但純紅色肌纖維不引起出生后分化[18]。Ⅰ型肌纖維百分比含量在9、18月齡下降的原因可能與脂肪含量有關(guān)。

肌纖維類型的組成比例、特性以及生理、生化的不同與肉品質(zhì)、產(chǎn)肉量以及口感等性能方面有著密切聯(lián)系[20]。劉艷芬等[21]對中國地方豬種的骨骼肌肌纖維類型進(jìn)行研究，在剛出生時，紅肌和白肌的組成沒有明顯區(qū)別，到生長后期白肌纖維含量較低，肉質(zhì)粗糙；白肌纖維徑度大于紅肌纖維，產(chǎn)肉量會偏高。研究表明[22]，肌纖維類型組成比例與產(chǎn)肉能力，尤其是與胴體質(zhì)量和脂肪雜交有緊密聯(lián)系。白色肌纖維的組成比例越低越有劣質(zhì)的脂肪交雜，沒有經(jīng)過雜交改良的品種則紅色肌纖維增多，可增加肉的風(fēng)味性。此外，自然圈養(yǎng)畜肉更能積累營養(yǎng)物質(zhì)，增加一些風(fēng)味物質(zhì)，如一些不飽和脂肪酸成分[23]。

因此，自然條件下烏珠穆沁羊生長過程中肌纖維類型的變化受外界天然環(huán)境的影響。環(huán)境變化對肉品質(zhì)以及產(chǎn)肉性能的提高也會產(chǎn)生影響。了解在自然條件下烏珠穆沁羊的生長變化規(guī)律，對我國地方優(yōu)良品種肉質(zhì)的改善，草原畜牧業(yè)生產(chǎn)和畜產(chǎn)品加工具有重要的實際意義。

3 結(jié) 論

隨著月齡的增加烏珠穆沁羊股二頭肌中Ⅰ型纖維百分含量在1月齡時最高，18月齡時最低。Ⅱa型肌纖維百分含量在12月齡時最高，6月齡時百分含量最低。Ⅱb型纖維百分含量在1月齡時最低，18月齡最高。整體上看，烏珠穆沁羊在生長過程中Ⅰ型、Ⅱb型肌纖維百分含量變化較大，Ⅱa纖維百分含量相對穩(wěn)定。肌纖維類型的組成直接影響羊肉品質(zhì)，通過對肉羊不同生長階段肌纖維類型變化規(guī)律進(jìn)行研究，了解地方優(yōu)良品種羊肉的肌纖維特點，為肉品質(zhì)控制方面（如嫩度、水分含量等）、肉質(zhì)的提高和改善提供理論依據(jù)。

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