句榮輝　黃廣學(xué)　羅紅霞等

摘要：研究食鹽含量、pH值、溫度對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的生長的影響，并主要研究植物乳桿菌和戊糖片球菌對產(chǎn)腸毒素和不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響以及之間的差別。結(jié)果表明：植物乳桿菌和戊糖片球菌均能抑制金黃色葡萄球菌的生長，植物乳桿菌的抑菌活性顯著高于戊糖片球菌（P<0.05），植物乳干菌和戊糖片球菌對不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的抑菌效果顯著高于產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌；戊糖片球菌；產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌；抑菌活性

中圖分類號：TS251 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）07-0006-04

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛存在于自然界中，易污染食品，是一種重要的食源性致病菌，是世界范圍內(nèi)的致病菌及食品安全的指示菌[1]。其主要致病因子為腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SE）和毒性休克綜合征毒素-1（itoxic shock syndrome toxin-1，TSST-1）等[2-3]，引起的食物中毒主要是食用了含有腸毒素的食品[4]。在美國和加拿大由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件分別為33%和45%[5]，在我國關(guān)于近幾年微生物性食物中毒病例中，20%～25%是由金黃色葡萄球菌引起的[6]。金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的食物中毒已成為世界性的公共衛(wèi)生問題[7]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酰、細(xì)菌素和抗生素等物質(zhì)對致病菌和腐敗菌具有抑菌或者殺菌的作用[8-9]。已有研究證明，在西式火腿、腌肉和香腸等發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)中接種乳酸菌可以促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味的形成，縮短腌制時間，改善制品色澤，延長制品的保藏期[10]。乳酸菌中的植物乳桿菌和戊糖片球菌作為常用的肉制品發(fā)酵劑，在發(fā)酵肉制品中有很大作用[11-12]。植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，屬于同型發(fā)酵乳酸菌[11]，與人類的生活關(guān)系密切，是一種常見于奶油、肉類發(fā)酵制品中的乳酸菌，所產(chǎn)植物乳桿菌素能夠抑制李斯特菌、沙門菌、金黃色葡萄糖球菌等食源性病原菌[13-14]。戊糖片球菌屬于乳酸菌屬，也可用作肉品發(fā)酵劑，張鳳寬等[15]將戊糖片球菌加入發(fā)酵香腸中，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵香腸成熟過程中活菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)顯著的增加，能有效抑制有害菌的生長，并顯著降低香腸中的亞硝酸鹽殘留量。

本實驗中金黃色葡萄球菌為從鮮肉中分離出的產(chǎn)腸毒素A和E的菌株，具有特殊性。關(guān)于植物乳桿菌和戊糖片球菌抑制有害菌的研究有大量的報道，但是對于產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌的抑制作用鮮有報道。本實驗主要研究了植物乳桿菌和戊糖片球菌對產(chǎn)腸毒素和不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與培養(yǎng)基

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由北京畜牧獸醫(yī)研究所畜產(chǎn)品加工研究實驗室早期實驗篩選得到；金黃色葡萄球菌：產(chǎn)腸毒素A和E的金黃色葡萄球菌是從鮮肉中分離出的一株具有代表性的菌株，金黃色葡萄球菌25923購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。

MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基、Baird-parker瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱、DHP-9025型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Model J-6M冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter有限公司；LDZM-60KCS智能型不銹鋼滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；H721型可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食鹽含量對金產(chǎn)腸毒素黃色葡萄球菌生長的影響

接種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌于食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、3%、4%、5%的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2h分別取樣測量吸光度，制作金黃色葡萄球菌生長曲線。

1.3.2 溫度對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

接種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后置于16、22、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，在0、4、8、12、16、20、24h分別取樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌計數(shù)，金黃色葡萄球菌計數(shù)按照國標(biāo)GB 4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗：金黃色葡萄球菌檢驗》進(jìn)行。

1.3.3 pH值對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

接種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌于pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2h分別取樣測量吸光度，制作金黃色葡萄球菌生長曲線。

1.3.4 戊糖片球菌和植物乳桿菌在不同溫度條件下對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

實驗分為3組，一組接種金黃色葡萄球菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，一組接種金黃色葡萄球菌和植物乳桿菌，一組接種金黃色葡萄球菌和戊糖片球菌，置于16、22、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，在0、4、8、12、16、20、24h分別取樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌計數(shù)，金黃色葡萄球菌計數(shù)按照GB 4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗：金黃色葡萄球菌檢驗》進(jìn)行。

1.3.5 戊糖片球菌和植物乳桿菌對產(chǎn)與不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

采用雙層牛津杯法：將約12mL已滅菌的下層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（2%瓊脂）冷卻至55℃左右，倒入培養(yǎng)皿后靜置凝固。滅菌的上層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（1%瓊脂）冷卻到50℃左右，加入1mL 106CFU/g金黃色葡萄球菌菌液混勻，然后將約10mL添加到已凝固的培養(yǎng)基上，靜置凝固。用鑷子將無菌牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，吸取一定濃度的植物乳桿菌和戊糖片球菌菌懸液0.1mL放至牛津杯中，將平板置于37℃中培養(yǎng)24h，測量抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 食鹽含量對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

由圖1可看出，在2%～5%食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基中，隨著食鹽含量上升金黃色葡萄球菌數(shù)量開始增長所需培養(yǎng)時間越長，這是因為金黃色葡萄球菌需要一段時間適應(yīng)環(huán)境的過程才能生長，但金黃色葡萄球菌數(shù)量變化的趨勢是一樣的，均隨生長時間延長而增長。因此在2%～5%食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)食鹽雖能減緩金黃色葡萄球菌的生長，但不能作為有效抑制金黃色葡萄球菌生長的柵欄因子。

2.2 溫度對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

由圖2可看出，在16～37℃范圍內(nèi)，隨溫度升高，產(chǎn)腸毒素高金黃色葡萄球菌數(shù)量增長的速度越快，16℃時金黃色葡萄球菌數(shù)量增長十分緩慢，而37℃時金黃色葡萄球菌增長快速。這說明溫度為抑制金黃色葡萄球菌的重要柵欄因子，低溫能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長。

2.3 pH值對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

由圖3可看出，pH值為5.5～6.5培養(yǎng)基中，在0～16h內(nèi)金黃色葡萄球菌均處于快速增長趨勢，但16h后金黃色葡萄球菌生長趨于穩(wěn)定且有小幅度下降，這是因為隨時間變化培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物和營養(yǎng)物質(zhì)消耗的原因；在pH5.0的培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌增長比較緩慢，因此pH≤5.0時對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用，pH5.5～6.5范圍內(nèi)不抑制金黃色葡萄球菌。

2.4 戊糖片球菌和植物乳桿菌在不同溫度下對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的影響

由圖4可看出，在16～37℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌增長速度越快，但是在每個溫度條件下植物乳桿菌和戊糖片球菌對金黃色葡萄球菌都能夠產(chǎn)生相同的抑制效果，植物乳桿菌和戊糖片球菌能夠顯著影響金黃色葡萄球菌的生長，由此可知，植物乳桿菌和戊糖片球菌是抑制金黃色葡萄球菌的關(guān)鍵柵欄因子。

2.5 植物乳桿菌和戊糖片球菌對產(chǎn)腸毒素與不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響

由圖5可看出，植物乳桿菌和戊糖片球菌對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈菌直徑菌大于10mm，說明植物乳桿菌和戊糖片球菌對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制效果。植物乳桿菌對產(chǎn)腸毒素或不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑顯著高于戊糖片球菌的抑菌圈直徑（P<0.05），說明植物乳桿菌對產(chǎn)腸毒素或不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的抑菌效果高于戊糖片球菌；植物乳桿菌和戊糖片球菌對不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌抑制效果顯著好于對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的抑制效果（P<0.05），說明產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的生長能力或者說存活能力高于不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌，產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌更加難以抑制。

3 結(jié) 論

在2%～5%食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能做為抑制產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的柵欄因子；低溫能抑制產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的生長；pH≤5.0時對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用，pH5.5～6.5時不抑制產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌；植物乳桿菌和戊糖片球菌在16～37℃范圍內(nèi)均能明顯抑制產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的生長；植物乳桿菌對產(chǎn)腸毒素或不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的抑制效果顯著好于戊糖片球菌（P<0.05），并且植物乳桿菌和戊糖片球菌對不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌抑制效果顯著好于對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的抑制效果；產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的存活能力優(yōu)于不產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌，因此產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌更難抑制。

參考文獻(xiàn)：

[1] SORIANO J M， FONT G， MOLT? J C， et al. Enterotoxigenic staphylococci and their toxins in restaurant foods[J]. Trends of Food Science and Technology， 2002， 13（2）： 60-67.

[2] DINGES M M， ORWIN P M， SCHLIEVERT P M. Exotoxins of Staphylococcus aureus[J]. Clinical Microbiology Review，2000， 13（1）： 16-34.

[3] McCORMICK J K， YARWOOD J M， SCHLIEVERT P M. Toxic shock syndrome and bacterial superantigens： an update[J]. Annual Review Microbiology， 2001， 55（10）： 77-104.

[4] SCHERRER D， CORTI S， MUEHLHERR J E， et al. Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulk-tank milk samples of goat and sheep[J]. Veterinary Microbiology， 2004， 101（2）： 101-107.

[5] TIRADO C， SCHIMDT K. WHO surveillance programe for control of food-borne infections and intoxications： preliminary results and trends across greater Europe[J]. Journal of Infection， 2001， 43（3）： 80-84.

[6] 張紅芝，朱召芹，陳海麗，等. 金黃色葡萄球菌食品分離株腸毒素基因分布及分型研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志， 2012， 24（5）： 417-420.

[7] LE LOIR Y， BARON F， GAUTIER M. Staphylococcus aureus and food poisoning[J]. Genetic and Molecular Research， 2003， 2（1）： 63-76.

[8] 劉艷姿. 乳酸菌的生理功能特性及應(yīng)用的研究[D]. 秦皇島：燕山大學(xué)，2010.

[9] 陳靜， 張玉蒼， 何連芳. 乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（4）： 1925-1927.

[10] 譚汝成， 歐陽加敏， 盧曉莉， 等. 接種植物乳桿菌和戊糖片球菌發(fā)酵對魚鲊品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué)， 2007， 28（12）： 268-272.

[11] 楊秀娟， 王艷梅， 馬儷珍. 植物乳桿菌和戊糖片球菌為發(fā)酵劑的發(fā)酵香腸工藝研究[J]. 肉類研究， 2007， 21（8）： 22-26.

[12] 劉樹立， 王春艷， 王華， 等. 肉制品發(fā)酵劑的研究進(jìn)展[J]. 中國調(diào)味品， 2007（4）： 31-36.

[13] KANDLER O， WEISS N. Bergeys manual of systematic bacteriology[M]. Baltimore： WilliamsWilkins， 1986： 1209-1229.

[14] 陳一然， 張明. 植物乳桿菌素的研究與應(yīng)用[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜質(zhì)， 2011， 23（9）： 853-856.

[15] 張鳳寬， 呂彩霞， 劉曉強(qiáng)， 等. 干酪乳桿菌和戊糖片球菌在發(fā)酵香腸中的作用研究[J]. 食品科學(xué)， 2009， 29（11）： 387-390.