杜永華　敖光輝　魏琴等

摘要：采用紙片擴(kuò)散法、二倍稀釋法、平板菌落計(jì)數(shù)法測定了油樟葉總黃酮、總多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌3種細(xì)菌的抑菌活性。結(jié)果表明，油樟葉總黃酮、總多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制活性均表現(xiàn)出一定的濃度依賴性，其MIC分別為16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL，MBC分別為16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。油樟葉總黃酮和總多糖均明顯干擾受試菌的正常生長過程。

關(guān)鍵詞：油樟；黃酮；多糖；抑菌活性

中圖分類號(hào)： R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0408-03

收稿日期：2014-11-24

基金項(xiàng)目：四川省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2011JY0050）；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃（編號(hào)：2011JTD0035）；四川省省屬高校科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（編號(hào)：14TD0031）。

作者簡介：杜永華（1978—），男，四川遂寧人，碩士，講師，主要從事天然產(chǎn)物及其生物活性研究。E-mail：yonghuad@163.com。

通信作者：魏琴，博士，教授，主要從事植物資源開發(fā)利用研究。E-mail：weiqin2011-67@163.com 。油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N. Chao]屬樟科樟屬植物，是我國特有樹種，主產(chǎn)于四川省宜賓市，其枝葉均富含揮發(fā)油，是食品、香料、醫(yī)藥、日用、化工產(chǎn)品的重要原料來源[1-2]。油樟與藥用植物香樟[Cinnamomum camphora （Linn.） Presl]為同屬植物，均具有多種藥理活性。研究表明，油樟葉揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗微生物活性[3-6]，提取揮發(fā)油后的油樟葉殘?jiān)崛∥锞哂锌刮⑸镒饔肹7-10]。目前關(guān)于油樟葉提取揮發(fā)油后殘?jiān)幕瘜W(xué)成分及其生物活性研究較少，關(guān)于油樟葉中總黃酮的抗菌活性研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)油樟葉提取揮發(fā)油后殘?jiān)械目傸S酮進(jìn)行抗菌活性研究，旨在為油樟資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

油樟葉采自宜賓市翠屏區(qū)邱場鄉(xiāng)油樟種植基地；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥92.5%，批號(hào)100080—200707，中國藥品生物制品檢定所）；D（+）-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，貴州迪大科技有限責(zé)任公司）；青霉素G鉀鹽（1 440 U/mg，Sigma 公司）；硫酸鏈霉素（720 U/mg，Sigma公司）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2菌種與培養(yǎng)基

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。營養(yǎng)瓊脂（NA）液體培養(yǎng)基：0.5 g牛肉膏，1 g蛋白胨，0.5 g氯化鈉，加熱攪拌溶解于100 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.3±0.1，121 ℃下高壓滅菌20 min，該培養(yǎng)基中加入1.5 g瓊脂即為固體培養(yǎng)基。

1.3主要儀器

AR2130電子天平（賽多利斯公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；LG-5A真空冷凍干燥機(jī)（上海離心機(jī)機(jī)械研究所有限公司）。

1.4方法

1.4.1油樟葉總黃酮的制備將新鮮油樟葉自然晾干，用水蒸氣蒸餾法除去揮發(fā)油，殘?jiān)?0±1） ℃烘干，粉碎，取過60～80目篩油樟葉粉末50 g，按料液比1 g ∶21 mL加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，室溫浸泡36 min，88 ℃水浴回流提取105 min；過濾，濾液于60 ℃減壓濃縮至浸膏，加100 mL 蒸餾水溶解，加入適量石油醚萃取至石油醚層無色，取水層濃縮至50 mL，加入乙醇溶液調(diào)節(jié)乙醇終濃度至80%，4 ℃醇沉過夜（除去多糖、蛋白、鞣質(zhì)等雜質(zhì)）；過濾，濾液減壓濃縮至膏稠狀，真空冷凍干燥，得總黃酮粗品。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系[11]測定油樟葉總黃酮含量。將油樟總黃酮粗品用10%乙醇溶液配制成濃度為64.00 mg/mL的儲(chǔ)備液，用直徑為0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.4.2油樟葉總多糖的制備取過60～80目篩除去揮發(fā)油的油樟葉干燥粉末50 g，按料液比1 g ∶20 mL加入水，100 ℃水浴回流提取3 h，過濾，濾液濃縮至1/5體積，加入乙醇溶液調(diào)節(jié)乙醇終濃度至80%，4 ℃醇沉過夜，12 000 r/min冷凍離心5 min，取沉淀真空冷凍干燥，得總多糖粗品。采用苯酚-硫酸法測定油樟葉總多糖含量。將油樟總多糖粗品用無菌水配制成濃度為64.00 mg/mL的儲(chǔ)備液，用直徑為0.22 μm 的微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.4.3菌株活化及菌懸液制備無菌條件下將保藏菌種接入NA平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h；挑去單個(gè)特征菌落接種于5 mL滅菌NA液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h；取0.5 mL菌懸液加入4.5 mL NA液體培養(yǎng)基中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用NA液體培養(yǎng)基稀釋菌懸液使其濃度為105～106 CFU/mL[7]，備用。

1.4.4抑菌效果的測定采用紙片瓊脂擴(kuò)散法[12]測定測試物的抑菌效果。將定性濾紙制成直徑為6 mm的圓紙片，置于潔凈干燥的試管內(nèi)，121 ℃濕熱滅菌20 min后烘干。測定100片濾紙片吸水量，根據(jù)吸水量在無菌條件下滴加不同濃度的藥液，使油樟總黃酮粗品、總多糖粗品的紙片含藥量均分別為512.00、256.00、170.67 μg/片，陽性對(duì)照紙片含藥量為青霉素G鉀鹽10 U/片、硫酸鏈霉素10 μg/片，37 ℃干燥后密閉低溫保存?zhèn)溆?。?.5 mL各菌懸液分別涂布于NA平板培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿放4張含藥濾紙，分別為油樟葉總黃酮、總多糖的3個(gè)濃度梯度及1個(gè)陽性對(duì)照，每個(gè)濃度3個(gè)平行。以放溶劑紙片的加菌培養(yǎng)基為溶劑對(duì)照，不加菌培養(yǎng)基為無菌對(duì)照。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈，若有，則用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4.5最小抑菌濃度（MIC）的測定采用二倍稀釋法[7]將油樟葉總黃酮粗品、總多糖粗品用相應(yīng)無菌溶劑稀釋成64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL的系列溶液，分別取0.5 mL總黃酮、總多糖溶液至4 mL NA液體培養(yǎng)基中，加入0.5 mL菌懸液，充分搖勻，37 ℃、 115 r/min搖床培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)無菌對(duì)照組（不含菌的NA液體培養(yǎng)基）、溶劑對(duì)照組（加相應(yīng)溶劑的含菌NA液體培養(yǎng)基）。用肉眼觀察法觀察每支試管中細(xì)菌的生長情況，以完全不長菌的濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.4.6最小殺菌濃度（MBC）的測定在MIC基礎(chǔ)上，從未見細(xì)菌生長的試管中取出0.5 mL培養(yǎng)物加入裝有4.5 mL NA液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取0.1 mL培養(yǎng)液用涂布平板法計(jì)數(shù)，以菌落數(shù)少于5個(gè)的最低濃度為油樟葉總黃酮、總多糖對(duì)該菌的最小殺菌濃度（MBC）[7]。

1.4.7抑菌曲線的測定參考陶翠等的方法[4]，用NA液體培養(yǎng)基將油樟葉總黃酮粗品、總多糖粗品配制成MIC濃度，分別接種3種細(xì)菌，使其終濃度為105 CFU/mL，充分混勻后于37 ℃培養(yǎng)，分別于0、2、4、8、12、24、36、48 h吸取1.0 mL菌液，按10倍比例稀釋，加入19 mL NA培養(yǎng)基混勻后制成平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)算菌落，根據(jù)稀釋濃度計(jì)算1 mL活菌數(shù)，以菌落數(shù)的對(duì)數(shù)為因變量，以培養(yǎng)時(shí)間為自變量在直角坐標(biāo)系中作圖，即得油樟葉總黃酮或總多糖對(duì)細(xì)菌的時(shí)間抑菌曲線，同時(shí)設(shè)含相應(yīng)菌的培養(yǎng)基空白對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1油樟葉總黃酮、總多糖含量測定

50 g提取揮發(fā)油后的油樟葉渣經(jīng)醇提法提取總黃酮，冷凍干燥獲得油樟葉總黃酮粗品4.60 g，經(jīng)比色法測得油樟葉總黃酮粗品中總黃酮含量為381.83 mg/g，油樟葉總黃酮提取率為3.51%；獲得油樟葉總多糖粗品2.65 g，經(jīng)苯酚-硫酸法測定總多糖粗品中總多糖含量為371.22 mg/g，總多糖提取率為1.97%。

2.2油樟葉總黃酮、總多糖的抑菌效果

由表1可知，油樟葉總黃酮、總多糖粗品對(duì)3株細(xì)菌均具有一定的抑菌作用，其抑菌圈直徑隨著紙片含藥量的增加而增加，表現(xiàn)出一定的劑量依耐性，但均低于陽性對(duì)照組。油樟總黃酮粗品對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈基本上大于油樟總多糖粗品，但油樟總多糖粗品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大于油樟總黃酮粗品。陽性藥物組對(duì)相應(yīng)細(xì)菌的抑菌圈均達(dá)到美國抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）的敏感水平，溶劑對(duì)照組、無菌對(duì)照組均無異常現(xiàn)象。512.0 μg/片油樟總黃酮粗品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑是10 U/片青霉素G鉀鹽的30.3%，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑是青霉素G鉀鹽的50.0%。

2.3油樟葉總黃酮、總多糖的最小抑菌濃度

由表2可知，無菌對(duì)照組無菌生長，溶劑對(duì)照組有菌生長。油樟葉總黃酮和總多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL。

2.4油樟葉總黃酮、總多糖的最小殺菌濃度

由表3可知，無菌對(duì)照組無菌生長，溶劑對(duì)照組有菌生長。油樟葉總黃酮、總多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌作用24 h后的最小殺菌濃度分別為16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。

2.5油樟葉總黃酮、總多糖抑菌曲線

由圖1至圖3可知，3種細(xì)菌在溶劑對(duì)照中均能正常生長，有較明顯的調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。油樟葉總黃酮、總多糖在1倍MIC下，金黃色葡萄球菌均直接進(jìn)入了衰亡期，表現(xiàn)出明顯的殺菌作用；1倍MIC總黃酮使枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的調(diào)整期延長，無明顯對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期，24 h內(nèi)緩慢生長，但活菌數(shù)量較溶劑對(duì)照組低，隨即進(jìn)入衰亡期；

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，油樟葉總黃酮、總多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均具有一定的抑菌活性，其抑菌效果隨著總黃酮、總多糖濃度的增加而增強(qiáng)。油樟總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC、MBC與總多糖相同，說明總黃酮、總多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用相當(dāng)?？傸S酮對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC、MBC均低于總多糖，表明總黃酮對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于總多糖。這一現(xiàn)象與光石韋總黃酮和多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的作用趨勢相似[12]。油樟葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌活性（MIC均為16.000 mg/mL）強(qiáng)于油樟葉乙醇提取物 （MIC均為31.25 mg/mL）[7]。與油樟同屬植物香樟葉在除去揮發(fā)油后的乙醇提取物主要成分為黃酮類化合物，其黃酮類化合物提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有較強(qiáng)抗菌活性[13-14]。由此可知，油樟葉總黃酮可能是油樟葉乙醇提取物中主要的抑菌成分。油樟葉總多糖對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性（MIC分別為16.000、32.000 mg/mL）弱于香樟葉水提取物（MIC均為15.63 mg/mL）[15]。孫崇魯研究表明，香樟葉水提取物含有較多的多糖成分[16]。但油樟葉總多糖的抑菌活性是否弱于香樟葉總多糖還有待進(jìn)一步研究。

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