廖國周 王桂瑛 程志斌等

摘要：騰沖雪雞是云南省騰沖縣的一個地方優(yōu)良家雞品種，具有羽毛潔白、肉骨烏黑、肉質(zhì)好、抗病性強等優(yōu)良特性。本研究以140日齡騰沖雪雞為對象，采用雙向電泳（DE）分析其腿肌與胸肌中蛋白表達差異，并以基質(zhì)輔助激光解析電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）鑒定腿肌與胸肌中差異蛋白質(zhì)點。結(jié)果表明，經(jīng)雙向電泳圖譜分析所獲得的肌肉組織蛋白點分布于pH4.0～7.0之間，蛋白點清晰，圖譜分辨率較好，其中腿肌中檢測到1421±34個蛋白點，胸肌中檢測到1329±25個蛋白點，對比分析腿肌和胸肌組織的DE圖譜，發(fā)現(xiàn)有110個點存在明顯的表達差異，在腿肌中高表達的點有56個，在胸肌中高表達的點有54個；選取的蛋白質(zhì)點經(jīng)鑒定為核纖層蛋白A、磷酸葡萄糖變位酶1、β-烯醇酶、超氧化物歧化酶、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、原肌原蛋白1，以及一些假設(shè)蛋白和非特征性蛋白。

關(guān)鍵詞：騰沖雪雞；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳

中圖分類號：TS207.3 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）07-0001-05

騰沖雪雞是云南省騰沖縣的一個優(yōu)良地方家雞品種，產(chǎn)于冬季積雪的高黎貢山地區(qū)，因羽毛潔白無斑而得名。其生長速度快，體型中等，具有肉骨烏黑、味香肉嫩、抗病力強等特性。目前，研究者已從體型外貌特征[1]、血液生化指標(biāo)[2]、肌肉營養(yǎng)成分[3]、屠宰性能[4]、肌纖維特性[5]與遺傳多樣性[6]等方面對其進行探討。鑒于騰沖雪雞是具有地方特色的家雞遺傳資源，需要從不同角度對其開展深入的系統(tǒng)研究。

蛋白質(zhì)是生命活動過程的功能單位，而蛋白質(zhì)組是指在特定的時間和環(huán)境條件下一個細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的表達。由于肌肉的主要成分是水和蛋白質(zhì)，因此對蛋白質(zhì)組進行分析，就可獲得大量的信息，進而闡明鑒定肉質(zhì)的各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[7-8]，并從全新的角度來分析已知的或新出現(xiàn)的肉質(zhì)問題[9]。目前，與家禽肉質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究還很少，且對于騰沖雪雞肌肉蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚未見報道，本研究旨在通過雙向電泳（dimensional electrophoresis，DE）分離騰沖雪雞肌肉蛋白，分析腿肌與胸肌中蛋白表達差異，并以基質(zhì)輔助激光解析電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）對分離的差異蛋白點進行鑒定，為探討騰沖雪雞不同部位肌肉品質(zhì)差異的內(nèi)在機理奠定基礎(chǔ)，并進一步為騰沖雪雞種質(zhì)資源的保護和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

140日齡騰沖雪雞由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗種雞場提供，屠宰后分別選取腿肌和胸肌作為樣品，并置于-80℃條件下待分析。

N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、碳酸氫銨與牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、丙烯酰胺、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）和3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸、N，N，N，N-四甲基乙二胺（tetramethyl ethylenediamine，TEMED）、過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）與碘乙酰胺 美國Amersham公司；胰酶與十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 普洛麥（北京）生物技術(shù)有限公司；固相pH梯度（immobilized pH gradients，IPG）緩沖液（pH4.0～7.0） 美國GE公司；固相pH梯度（IPG）干膠條（24cm，pH4.0～7.0） 美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Ettan IPGphor Ⅲ等電聚焦電泳儀、Ettan DALTsix二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳儀 美國GE公司；Powerlook1100凝膠掃描儀 美國Umax公司；Autoflex speed? MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀 德國Bruker Dalton公司。

1.3 方法

騰沖雪雞腿肌和胸肌中蛋白質(zhì)組分析參考文獻[10]的方法并稍作修改。

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取及純化

取1g騰沖雪雞肉樣以液氮研磨成粉，加入10倍體積-20℃預(yù)冷的10% TCA/丙酮溶液，-20℃沉降過夜，隨后在4℃、12000r/min離心20min，棄上清液，沉淀物加預(yù)冷丙酮洗滌，在4℃、12000r/min離心15min，重復(fù)2次，沉淀經(jīng)真空干燥后，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

稱取蛋白質(zhì)干粉20mg，加0.5mL裂解液（含1mmol/L PMSF，7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS（3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸），0.02mol/L Tris-bases（三羥甲基氨基甲烷），超聲裂解30min，將超聲后的蛋白混合物于4℃、12000r/min離心20min，收集上清液，通過Braford法[11]測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 雙向電泳

1.3.3.1 等電聚焦電泳

等電聚焦電泳參照IPGphor III等電聚焦系統(tǒng)使用指南進行。騰沖雪雞肌肉蛋白與水化液（含7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4% CHAPS、1% DTT、0.7% IPG緩沖液、0.002%溴酚藍）充分混合后至上樣總體積為460μL。非線性IPG干膠條膠面朝下放入水化液，覆蓋一層礦物油防止等電聚焦時尿素析出、蛋白氧化及產(chǎn)生冷凝水，置于Ettan IPGphor等電聚焦儀中，重泡脹和等電聚焦均在20℃進行，每根膠條限流50μA。

1.3.3.2 膠條平衡

等電聚焦完畢后，膠條先在8mL平衡緩沖液Ⅰ（含0.05mol/L Tris-HCl pH8.8，6mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚藍，0.1mol/L DTT）中平衡15min，再在8mL平衡緩沖液Ⅱ（以0.25mol/L碘乙酰胺替換0.1mol/L DTT，其余組分同平衡緩沖液Ⅰ）中平衡15min。

1.3.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%的凝膠上端，用0.8%低熔點瓊脂糖封頂，待瓊脂糖凝固后即可進行第二向SDS凝膠電泳。電泳參數(shù)設(shè)置：初始功率為2W/膠條，運行45min，然后加大功率至17W/膠條，直至溴酚藍指示線跑至膠底緣時電泳結(jié)束，約4.5h。IPG膠條的最大電流為50μA/膠條，凝膠厚度為1mm。

1.3.4 染色與圖像分析

電泳結(jié)束后剝離凝膠，置于考馬斯亮藍溶液中固定染色2～4h，換脫色液脫色，直到背景無色透明，蛋白點清晰為止。脫色后的雙向電泳凝膠經(jīng)掃描儀掃描保存圖像，圖像分析采用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件進行。

1.3.5 質(zhì)譜樣品制備與質(zhì)譜分析

切下目的蛋白點使用Autoflex speed? MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進行分析，條件為激光波長355nm、重復(fù)速率200Hz、加速電壓20kV、最優(yōu)質(zhì)量分辨率1500u。利用軟件flexAnalysis過濾基線峰、識別信號峰，以BioTools軟件搜索美國國家生物信息中心（National Center For Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 騰沖雪雞肌肉蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜

對騰沖雪雞肌肉蛋白進行的雙向電泳實驗均重復(fù)3次。實驗以pH4.0～7.0、24cm非線性IPG干膠條分別對騰沖雪雞腿肌肉和胸肌肉蛋白進行分離，并利用考馬斯亮藍進行染色。由圖1可見，電泳分離較充分，腿肌肉共發(fā)現(xiàn)1421±34個蛋白質(zhì)點，胸肌肉共發(fā)現(xiàn)1329±25個蛋白質(zhì)點，清晰可辨，圖像拖帶、條紋不明顯，能滿足進一步分析的需要。通過ImageMaster 2D Platinum軟件分析凝膠上的蛋白質(zhì)點發(fā)現(xiàn)，騰沖雪雞腿肌與胸肌的雙向電泳表達譜基本相似，但是有部分蛋白點的表達有差異，其中在腿肌的蛋白電泳圖譜上有56個蛋白點明顯高表達，而在胸肌的蛋白電泳圖譜上則有54個蛋白點明顯高表達。圖2中分別列舉了部分具有明顯變化的蛋白質(zhì)點的局部放大圖。

2.2 差異表達蛋白質(zhì)的鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索

選取的差異蛋白斑點經(jīng)過酶解之后，以MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析得到肽質(zhì)量指紋圖譜，由圖3和圖4可見，圖譜信號都較強且基線平穩(wěn)。獲得的m/z數(shù)據(jù)送入NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫，通過Mascot搜索引擎檢索，檢索分值在67分以上視為可信結(jié)果（P<0.05）。根據(jù)檢索結(jié)果，鑒定的騰沖雪雞腿肌和胸肌中差異表達蛋白的相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。由表1可見，騰沖雪雞腿肌和胸肌中分別鑒定出9種和10種蛋白，主要為核纖層蛋白A、磷酸葡萄糖變位酶1、β-烯醇酶、超氧化物歧化酶、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、原肌原蛋白1，以及一些假設(shè)蛋白和非特征性蛋白。

3 討 論

畜禽肌肉中蛋白質(zhì)含量超過20%，肉品質(zhì)與肌肉蛋白質(zhì)之間存在密切聯(lián)系，因此肉品科學(xué)要與功能蛋白質(zhì)研究相結(jié)合。蛋白質(zhì)組是指一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。近年研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)組與肉的嫩度相關(guān)[12]。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)最直接、最有效的方法，其目的是從整體的角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律，鑒定并分析感興趣的個別蛋白[13]。目前與家禽肉質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究很少。Doherty等[14]對蛋雞胸肌蛋白質(zhì)組所做的研究表明，蛋雞生長期內(nèi)幾種蛋白質(zhì)的相對表達水平均有極大變化，表明蛋白質(zhì)組分析的復(fù)雜性，然而它是人們更深入了解家禽生長期間肌肉變化情況的第一步，具有重要意義。

本實驗通過雙向電泳分離騰沖雪雞腿肌和胸肌中的總蛋白，分析這兩個部位蛋白質(zhì)表達的差異，發(fā)現(xiàn)兩個部位間有110個蛋白或肽段存在差異表達，隨后以MALDI-TOF/TOF MS對分離的差異蛋白點進行鑒定，數(shù)據(jù)庫檢索后，腿肌中鑒定出9種蛋白，胸肌中鑒定出10種蛋白，分別為核纖層蛋白A、磷酸葡萄糖變位酶1、烯醇酶、超氧化物歧化酶、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、原肌原蛋白1，以及一些假設(shè)蛋白和非特征性蛋白。得到的19個蛋白點。根據(jù)功能可分為4類，即結(jié)構(gòu)蛋白、收縮蛋白、代謝蛋白及未分類蛋白。核纖層蛋白A是細胞核內(nèi)骨架蛋白，是構(gòu)成核纖層的主要成分，屬于中間纖維的一種。近年來發(fā)現(xiàn)，核纖層蛋白A能夠促進骨骼肌成肌細胞的分化，促進骨骼肌的生長[15]。磷酸葡萄糖變位酶1是生物體組織中廣泛存在的一組重要的酶類。它可以催化葡萄糖-1-磷酸鹽和葡萄糖-6-磷酸鹽相互轉(zhuǎn)化，在糖代謝中起著重要的作用。烯醇酶在糖酵解過程提供能量，其活性可作為肌形成的指標(biāo)，肌肉組織中的烯醇酶主要包括α和β亞型，其中β型稱為肌肉特異性烯醇酶[16]，本實驗中騰沖雪雞腿肌的β-烯醇酶表達量較胸肌的高，表明腿肌生長速度較胸肌快。肌酸激酶-M型參與能量轉(zhuǎn)化，可逆的催化磷酸鹽在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和肌酸的轉(zhuǎn)化[17]。超氧化物歧化酶是清除自由基的主要酶之一，它可以催化清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基，從而阻斷自由基的連鎖反應(yīng)，保護機體免受其害[18]。乙二醛酶1是一種以谷胱甘肽作為輔酶，將甲基乙二醛轉(zhuǎn)化為乳酸的酶。原肌球蛋白1的主要作用是加強和穩(wěn)定肌動蛋白絲，抑制肌動蛋白與肌球蛋白結(jié)合。另外，本實驗中還鑒定出一些未分類的假設(shè)蛋白和非特征性蛋白，這些蛋白質(zhì)的功能以及蛋白質(zhì)之間的相互作用，還有待做更進一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究利用雙向電泳技術(shù)，建立了騰沖雪雞肌肉蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜，分析了騰沖雪雞腿肌與胸肌中蛋白質(zhì)表達差異，并利用MALDI- TOF/TOF MS對這些差異表達蛋白質(zhì)進行鑒定，為進一步深入研究騰沖雪雞不同部位肌肉品質(zhì)差異的內(nèi)在機制奠定基礎(chǔ)。

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