腎小管上皮細(xì)胞(RTECs)的凋亡壞死是急性腎損傷(AKI)最主要的病理表現(xiàn)，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在活體內(nèi)外均可分化為RTECs的潛能[1-3]，移植BMSCs對(duì)AKI修復(fù)具有重要意義。

目前BMSCs移植主要是采用靜脈注射，因此BMSCs向損傷組織的歸巢成為移植治療疾病的關(guān)鍵。Ji等[4]報(bào)道BMSCs可表達(dá)CXCR4，它是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)的受體，兩者構(gòu)成SDF-1/CXCR4生物軸在BMSCs的歸巢中起重要作用，對(duì)該生物軸的調(diào)控將影響移植BMSCs的歸巢能力及疾病治療效果。

低氧是各種原因造成組織損傷的微環(huán)境特征，細(xì)胞的低氧/復(fù)氧(HR)是導(dǎo)致凋亡壞死的最主要病理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)即采用HR預(yù)處理RTECs誘導(dǎo)其凋亡，形成HR-RTECs體外模擬缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)增強(qiáng)BMSCs的CXCR4表達(dá)，采用Transwell體系將CXCR4-BMSCs與HR-RTECs共培養(yǎng)，觀察CXCR4基因修飾對(duì)BMSCs向AKI微環(huán)境定向遷移的影響，并檢測相關(guān)信號(hào)蛋白水平，探討其可能機(jī)制。構(gòu)建AKI小鼠模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察CXCR4-BMSCs移植后向損傷腎組織的遷移效果，為提高BMSCs移植治療AKI效果提供思路。

材料與方法

材料小鼠BMSCs和RTECs(ATCC公司)，293FT細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所)，實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0003]，實(shí)驗(yàn)在第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(滬)2007-0003。Gateway? BP ClonaseTMII Enzyme Mix、Gateway? LR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix和Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)，質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技公司)，成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，Anaero培養(yǎng)袋(MGC公司)，Transwell小室(Coring公司)、BMSCs完全培養(yǎng)基(Sciencell 公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Invitrogen公司)，兔抗小鼠CXCR4單抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，兔抗小鼠磷酸化絲氨酸激酶(pAKT)單抗和磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(pMAPK)單抗(CST公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(Southern biotech公司)，SDF-1 ELISA檢測試劑盒(上海圓創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)，5溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)及BrdU單克隆抗體(Sigma公司)。

CXCR4目的質(zhì)粒構(gòu)建、慢病毒包裝及BMSCs轉(zhuǎn)染利用Gateway技術(shù)構(gòu)建含CXCR4基因的目的質(zhì)粒[示蹤基因?yàn)榫G色熒光蛋白(eGFP)]，同時(shí)構(gòu)建空白對(duì)照載體(僅攜帶eGFP)。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，分別包裝產(chǎn)生攜帶CXCR4質(zhì)粒及空載體的慢病毒顆粒，結(jié)晶紫染色法測定慢病毒滴度。BMSCs按2×105接種至六孔板，各自加入25 μl上述兩種慢病毒原液，轉(zhuǎn)導(dǎo)16h后更換成BMSCs完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。采用500 μg/ml的新霉素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行純化篩選，每2d更換一次培養(yǎng)液直至空白BMSCs全部凋亡。計(jì)數(shù)eGFP陽性細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染效率以eGFP陽性率表示。構(gòu)建好的CXCR4-BMSCs、null-BMSCs備用。

轉(zhuǎn)染BMSCs活力檢測CXCR4-BMSCs、null-BMSCs和BMSCs三組細(xì)胞均按2×103/孔接種至96孔板，培養(yǎng)1，2，3，4，5，6，7d，四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測各組細(xì)胞的增生能力。

轉(zhuǎn)染BMSCs分化潛能檢測

成骨誘導(dǎo)分化檢測 CXCR4-BMSCs和null-BMSCs接種于六孔板，貼壁生長達(dá)80％融合后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)21d，PBS漂洗，4％多聚甲醛固定30 min，加入茜素紅染液染色5 min，漂洗后顯微鏡下觀察。

成脂誘導(dǎo)分化檢測 CXCR4-BMSCs和null-BMSCs貼壁生長達(dá)100％融合后加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)18d，PBS漂洗，4％多聚甲醛固定30 min，油紅O染液染色10 min，漂洗后顯微鏡下觀察。

轉(zhuǎn)染BMSCs的CXCR4表達(dá)

mRNA水平檢測 RT-PCR檢測兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CXCR4 mRNA表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參，PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，98℃ 30s，60℃ 60s，72℃ 60s，30個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸5 min，3％的瓊脂糖凝膠電泳。

蛋白水平檢測 Western 印跡法：裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后加入兔抗小鼠CXCR4單抗，4℃孵育過夜，清洗后加入羊抗兔IgG繼續(xù)孵育1h。ECL作用1～2 min，將混合液滴加于 PVDF 膜表面，孵育1～2 min，置于Fiuorchem HD2凝膠成像分析系統(tǒng)，觀察、拍照。測量條帶的灰度值，GAPDH為內(nèi)參，蛋白的表達(dá)強(qiáng)度為兩者灰度的比值。

細(xì)胞準(zhǔn)備及分組BMSCs、CXCR4-BMSCs、null-BMSCs及RTECs、HR-RTECs均采用0.25％胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為108/ml，培養(yǎng)液中懸浮1h恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)備用。其中HR-RTECs是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)將RTECs首先置于Anaero培養(yǎng)袋(92％N2+3％O2+5％CO2)中使用無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，移至5％CO2培養(yǎng)箱(95％O2+5％CO2)換用含10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h獲得。采用Transwell體系進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)：Transwell小室嵌入六孔板中，BMSCs于Transwell小室中培養(yǎng)，RTECs于六孔板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分4組：BMSCs/RTECs共培養(yǎng)組(對(duì)照組，組1)、BMSCs/HR-RTECs共培養(yǎng)組(組2)、CXCR4-BMSCs/HR-RTECs共培養(yǎng)組(組3)、null-BMSCs/HR-RTECs共培養(yǎng)組(組4)，各組BMSCs的接種密度為1.8×105/室，RTECs的接種密度為4×105/孔，均共培養(yǎng)48h。

BMSCs的遷移能力共培養(yǎng)結(jié)束后取出Transwell小室，以棉簽輕輕拭去微孔膜上層細(xì)胞，對(duì)微孔膜下細(xì)胞染色：PBS清洗3遍，4％多聚甲醛固定20 min，1％結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗至紫色消失，顯微鏡下觀察濾膜并隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)非重復(fù)視野下細(xì)胞數(shù)，取均值。每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。

RTECs培養(yǎng)上清中SDF-1濃度檢測共培養(yǎng)48h后移去Transwell小室，收集六孔板中的RTECs培養(yǎng)上清液，按照SDF-1 ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行上清中SDF-1濃度測定。每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。

BMSCs內(nèi)相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)細(xì)胞分組共培養(yǎng)完畢后，將各組Transwell小室移至空白六孔板，加入裂解液裂解BMSCs，采用前述Western印跡方法檢測，加入的一抗分別為兔抗小鼠pAKT單抗和pMAPK單抗。

小鼠AKI模型的制備、實(shí)驗(yàn)分組及處理采用夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂30 min再開放30 min的方法建立缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI模型。用含10 μmol/L BrdU標(biāo)記液的低糖DMEM培養(yǎng)液對(duì)BMSCs、CXCR4-BMSCs、null-BMSCs各自孵育72h后分別獲得BrdU標(biāo)記的干細(xì)胞(BrdU-BMSCs、BrdU-CXCR4-BMSCs和BrdU-null-BMSCs)[5]。AKI小鼠隨機(jī)分為3組：BMSCs移植組(6只，尾靜脈注射2×106個(gè)BrdU-BMSCs)、CXCR4-BMSCs移植組(6只，尾靜脈注射2×106個(gè)BrdU-CXCR4-BMSCs)和null-BMSCs移植組(6只，尾靜脈注射2×106個(gè)BrdU-null-BMSCs)。各組小鼠均在適宜的溫度、濕度環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食水，于建模后7d處死，0.01 mmol/L PBS經(jīng)心臟沖洗血液后取雙側(cè)腎臟，再用上述濃度的PBS液對(duì)獲取的腎臟進(jìn)行沖洗，10％甲醛固定備作免疫組化檢查。

腎組織中BrdU+細(xì)胞(BMSCs)的分布常規(guī)石蠟包埋，切片置于二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，0.3％H2O2室溫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，置入有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中加抗原修復(fù)液，微波加熱暴露抗原(98℃ 3 min)。切片與BrdU單克隆抗體4℃孵育16h。PBS洗片后HRP標(biāo)記抗小鼠IgG，37℃孵育1h，洗片后加DAB底物顯色液15 min，蘇木素襯染，常規(guī)樹脂封片，室溫保存。測量方法：每份標(biāo)本分別選取15個(gè)髓質(zhì)部非重疊視野(×200倍)，計(jì)數(shù)腎小管上皮組織中BrdU+細(xì)胞所占百分比，取其均數(shù)納入統(tǒng)計(jì)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間差異采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

CXCR4質(zhì)粒獲得、慢病毒包裝及BMSCs轉(zhuǎn)染Gateway技術(shù)成功獲取包含CXCR4及eGFP基因的目的質(zhì)粒，同時(shí)獲得僅含eGFP的對(duì)照質(zhì)粒。兩種質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后，可見細(xì)胞膜融合形成多核體細(xì)胞，熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，提示慢病毒包裝成功。兩種慢病毒滴度分別為8.7×107TU/ml、9.1×107TU/ml。將這兩種慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs并經(jīng)新霉素篩選3～4d后空白細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染細(xì)胞)完全凋亡，分別獲得CXCR4-BMSCs(攜帶CXCR4和eGFP)和null-BMSCs(僅攜帶eGFP)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞純度可達(dá)95％。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞活力及多向分化潛能鑒定經(jīng)MTT檢測顯示，CXCR4-BMSCs及null-BMSCs均生長良好，其增生能力與BMSCs無差異(圖1)。CXCR4-BMSCs和null-BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)均可形成明顯鈣結(jié)節(jié)，培養(yǎng)21d后茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)18d后，油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀。

圖1 三種BMSCs MTT檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染細(xì)胞CXCR4水平檢測經(jīng)RT-PCR及Western印跡檢測均顯示CXCR4-BMSCs的CXCR4表達(dá)在mRNA及蛋白水平均高于null-BMSCs(圖2、3)。

圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CXCR4 mRNA表達(dá)(RT-PCR)

各組BMSCs的體外遷移結(jié)果顯微鏡下遷移的BMSCs呈現(xiàn)紫色。各組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為10.83±2.32、19.00±2.37、50.83±5.57、20.17±3.76；與HR-RTECs 共培養(yǎng)可增強(qiáng)BMSCs的遷移能力(P<0.05)；空載體轉(zhuǎn)染并不額外影響B(tài)MSCs的遷移能力，而經(jīng)CXCR4基因修飾的BMSCs向AKI微環(huán)境的遷移能力進(jìn)一步顯著增強(qiáng)(P<0.05)(圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CXCR4蛋白表達(dá)(Western印跡法)

圖4 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外遷移結(jié)果

SDF-1水平ELISA檢測顯示HR-RTECs培養(yǎng)上清中的SDF-1濃度顯著高于RTECs培養(yǎng)上清(P<0.05)(圖5)，與不同BMSCs共培養(yǎng)并不影響HR-RTECs上清的SDF-1水平。

圖5 不同腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中的SDF-1濃度

BMSCs內(nèi)相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)經(jīng)Western印跡檢測，HR-RTECs共培養(yǎng)環(huán)境可增加BMSCs內(nèi)pMAPK水平(P<0.05)，pAKT水平無顯著升高；空載體轉(zhuǎn)染對(duì)pAKT和pMAPK水平并無額外影響，但CXCR4基因修飾的BMSCs內(nèi)pAKT和pMAPK水平均有顯著增加(P<0.05)(圖6)。

圖6 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的pAKT(A)和PMAPK(B)表達(dá)

腎組織中BrdU+細(xì)胞(BMSCs)的分布光鏡下細(xì)胞核呈棕褐色為BrdU+細(xì)胞，三組小鼠的腎小管上皮組織中，均有部分細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色(圖7)。BMSCs移植組和null-BMSCs移植組的BrdU+陽性細(xì)胞的比例無差異，但CXCR4-BMSCs移植組的BrdU+陽性細(xì)胞比例顯著增加(圖8)。

圖7 三組小鼠腎組織內(nèi)BrdU+細(xì)胞(LH，×200)

圖8 三組小鼠腎組織內(nèi)BrdU+細(xì)胞百分比

討 論

許多研究證實(shí)移植的外源性BMSCs可向損傷腎臟遷移，參與AKI修復(fù)，但改善能力有限[6，7]。移植細(xì)胞向損傷部位的歸巢和定植是治療前提，因此提高BMSCs的定向遷移歸巢能力對(duì)增強(qiáng)其AKI修復(fù)效果將甚為重要。多種渠道的移植(損傷局部移植[8]、靜脈注射移植[9])研究均證實(shí)，損傷局部產(chǎn)生的趨化因子是介導(dǎo)BMSCs遷移的重要介質(zhì)，SDF-1/CXCR4是目前研究的熱點(diǎn)。SDF-1為CXC亞家族成員，在體內(nèi)多種臟器中均有表達(dá)，損傷局部的缺血微環(huán)境將上調(diào)SDF-1的表達(dá)[10，11]。本研究中我們將RTECs進(jìn)行HR預(yù)處理，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其凋亡率為32.82％±1.16％，與AKI小鼠的腎小管組織凋亡率一致[12]，可用于體外模擬AKI。經(jīng)檢測經(jīng)此預(yù)處理的RTECs上清中SDF-1濃度有顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

雖然CXCR4在BMSCs細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，但正常時(shí)僅存在于細(xì)胞內(nèi)[14]，只在損傷產(chǎn)生的特定細(xì)胞因子動(dòng)員時(shí)CXCR4才從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面[15]。SDF-1即可作為此動(dòng)員劑[16]，并與遷移至細(xì)胞表面的CXCR4特異結(jié)合介導(dǎo)BMSCs定向遷移。本研究也觀察到了這一現(xiàn)象，隨著HR-RTECs培養(yǎng)上清中SDF-1濃度增加，共培養(yǎng)BMSCs的遷移數(shù)量顯著增加，但這種增加也是有限的，BMSCs的CXCR4低表達(dá)或許是其中的原因。事實(shí)上，BMSCs的多次分離培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致CXCR4的合成分泌能力下降，Honczarenko等[17]經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)BMSCs在體外被傳代至12代時(shí)，僅能檢出24％～41％CXCR4陽性細(xì)胞，至第16代則降至0～16％。而移植治療時(shí)為了獲取足夠數(shù)量的移植細(xì)胞，又必須對(duì)BMSCs進(jìn)行體外擴(kuò)增，這就導(dǎo)致了用于移植治療的BMSCs僅微量表達(dá)CXCR4，本研究也觀察到CXCR4在null-BMSCs中的低表達(dá)。因此，在BMSCs體外擴(kuò)增用于移植治療AKI時(shí)，雖然AKI腎組織中SDF-1水平升高，但由于CXCR4的低表達(dá)，升高的SDF-1并不能充分動(dòng)員CXCR4轉(zhuǎn)移至BMSCs表面并與之結(jié)合，限制了BMSCs的腎臟定向遷移及移植修復(fù)效應(yīng)。因此，提高BMSCs的CXCR4表達(dá)可能成為提高移植BMSCs的AKI修復(fù)效能的新思路。

本研究利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建攜帶CXCR4目的基因的質(zhì)粒及相應(yīng)的空載體對(duì)照，并以慢病毒為載體成功轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的純度可達(dá)95％。RT-PCR及Western印跡檢測顯示CXCR4-BMSCs的CXCR4表達(dá)明顯增強(qiáng)，并且慢病毒轉(zhuǎn)染并未影響B(tài)MSCs的生長特性及多向分化潛能。通過Transwell體系觀察到CXCR4基因修飾的BMSCs遷移數(shù)量進(jìn)一步增加，我們認(rèn)為這是由于隨著CXCR4表達(dá)增加，HR-RTECs上清中的SDF-1可動(dòng)員更多的CXCR4轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面并與之結(jié)合，增強(qiáng)BMSCs的遷移能力，而空載體轉(zhuǎn)染的BMSCs并無此變化。這一現(xiàn)象也經(jīng)過我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)，AKI小鼠經(jīng)CXCR4-BMSCs移植7d后，腎組織中BrdU+細(xì)胞(BMSCs)的比例顯著增高。

目前尚不十分清楚SDF-1與CXCR4結(jié)合后通過何種機(jī)制介導(dǎo)BMSCs的遷移。AKT和MAPK信號(hào)通路研究較多，它們的激活可增加BMSCs內(nèi)與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白分泌；介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，降解細(xì)胞外基質(zhì)，利于BMSCs的遷移[18]；還可激活纖溶酶降解纖溶蛋白凝塊有助于BMSCs進(jìn)入損傷組織[19]。我們也觀察到CXCR4-BMSCs的pAKT和pMAPK水平有顯著升高，認(rèn)為這是由于隨著更多SDF-1與轉(zhuǎn)移至BMSCs表面的CXCR4結(jié)合，AKT和MAPK磷酸化加強(qiáng)，進(jìn)而介導(dǎo)更多BMSCs遷移，在急性心肌梗塞及骨損傷模型中均有類似報(bào)道[20,21]。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的CXCR4-BMSCs細(xì)胞可在SDF-1/CXCR4軸的介導(dǎo)下，通過下游的AKT和MAPK信號(hào)通路活化，向AKI微環(huán)境的定向遷移能力顯著增加，將其用于體內(nèi)移植時(shí)，有望增強(qiáng)AKI修復(fù)效應(yīng)。

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