腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增多、沉積及腎臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)，是腎間質(zhì)纖維化(RIF)的重要機(jī)制之一。目前已發(fā)現(xiàn)高糖、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)及血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等均可促進(jìn)TEMT。內(nèi)皮素-1(ET-1)作為重要的致炎及促纖維化分子，與其受體結(jié)合后通過(guò)各種途經(jīng)促進(jìn)ECM增多、細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而介導(dǎo)RIF。隨著對(duì)RIF發(fā)生機(jī)制的深入研究，ET-1在TEMT中的作用越來(lái)越受到重視。目前已有學(xué)者在糖尿病腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)ET-1與TEMT關(guān)系密切[1]，也有學(xué)者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ET-1可能參與了高糖誘導(dǎo)的TEMT[2]，但是ET-1對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的直接作用目前研究較少。本研究應(yīng)用ET-1刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞并進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察相關(guān)指標(biāo)的變化，旨在探討ET-1是否能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化及可能的分子機(jī)制。

材料與方法

主要材料腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科余學(xué)清教授惠贈(zèng))，DMEM培養(yǎng)基(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司)，ET-1、BQ123、SB203580(美國(guó)Sigma公司)，小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體、兔抗大鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)多克隆抗體(美國(guó)abcam公司)，兔抗大鼠E鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(上海生工)，兔抗大鼠p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)單克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化-p38MAPK(p-p38MAPK)單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，Western印跡設(shè)備(美國(guó)Bio-Rad公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，RT-PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組NRK52E于含10％牛胎血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中37℃，5％CO2貼壁培養(yǎng)，以0.25％胰酶消化，1∶4傳代，待生長(zhǎng)至70％～80％融合時(shí)用無(wú)血清的培養(yǎng)基同步化12h后進(jìn)行分組：陰性對(duì)照組；ET-1濃度梯度組：ET-1(10-11、10-9、10-7mol/L)刺激細(xì)胞60h；ET-1時(shí)間梯度組：ET-1(10-7mol/L)刺激細(xì)胞12h、24h、36h、48h、60h；BQ123預(yù)處理組：BQ123(2 μg/ml)預(yù)處理0.5h后ET-1(10-7mol/L)刺激細(xì)胞60h；SB203580預(yù)處理組：SB203580(10-5mol/L)預(yù)處理0.5h 后ET-1(10-7mol/L)刺激細(xì)胞60h。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

Western印跡法檢測(cè)E-cadherin、α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表達(dá)收集各組細(xì)胞，按照全細(xì)胞裂解液說(shuō)明書提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每份樣本取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在含5％脫脂牛奶的1×TBST中室溫封閉1h。孵育一抗，加入E-cadherin抗體(1∶200)，α-SMA抗體(1∶500)，p38MAPK和p-p38MAPK抗體(1∶500)及GAPDH抗體(1∶1000)4℃過(guò)夜。次日TBST漂洗3次，10min，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔及馬抗小鼠二抗(1∶500)室溫孵育1.5h，TBST漂洗3次，10 min。DAB顯色、成像。按相同實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。ImageJ軟件分析目的條帶灰度值。

RT-PCR法檢測(cè)E-cadherin及α-SMA mRNA的表達(dá)按照TRIzol說(shuō)明書在培養(yǎng)瓶中提取各組細(xì)胞的總RNA，經(jīng)紫外線分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，取總RNA 2 μg作逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書。取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：E-cadherin上游引物5’- CTACCCACGGCAAGTTCAAT- 3’，下游引物5’-GGA TGCAGGGATGAT-3’；α-SMA上游引物5’-CCCTAAAACCCTAAAGCCAACA-3’，下游引物5’-GCAGTGCATAGCCCTCGT-3’；GAPDH上游引物5’-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3’，下游引物5’-GGATGCAGGGATGAT-3’，擴(kuò)增條件：E-cadherin預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)后72℃ 5 min；α-SMA退火55℃，GAPDH退火54℃，其余條件同前。將PCR產(chǎn)物加入1.25％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，用GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，成組設(shè)計(jì)資料多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

ET-1、SB203580和BQ123對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察陰性對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中始終呈典型的鵝卵石樣，融合狀態(tài)時(shí)細(xì)胞間連接緊密，以ET-1(10-7mol/L)刺激細(xì)胞60h后，細(xì)胞呈梭形改變，放射狀排列，細(xì)胞間隙明顯增大，分別應(yīng)用SB203580和BQ123預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞的梭形改變明顯減輕。

不同濃度ET-1對(duì)細(xì)胞E-cadherin及α-SMA表達(dá)的影響應(yīng)用濃度為10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L 的ET-1刺激細(xì)胞60h，各濃度組E-cadherin蛋白和mRNA的表達(dá)均低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，并隨著濃度的升高，表達(dá)逐漸減少，α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)均高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，并隨著濃度升高，表達(dá)增多(圖1)。

ET-1作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞E-cadherin及α-SMA表達(dá)的影響ET-1(10-7mol/L)刺激細(xì)胞12h、24h、36h、48h、60h，E-cadherin蛋白和mRNA的表達(dá)在36h顯著減少(P<0.05)，于60h達(dá)最低值(P<0.05)，α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)在36h顯著增加(P<0.05)，于60h達(dá)高峰(P<0.05)(圖2)。

圖1 不同濃度ET-1對(duì)E-cadherin及α-SMA表達(dá)的影響

圖2 ET-1作用不同時(shí)間對(duì)E-cadherin及α-SMA表達(dá)的影響

ET-1、SB203580和BQ123對(duì)細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)及p38MAPK磷酸化水平的影響以p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)量代表p38MAPK磷酸化水平，即p38MAPK活性。與陰性對(duì)照組相比，ET-1組E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK表達(dá)增加，p38MAPK活性增強(qiáng)(P<0.05)；與ET-1組相比，SB203580預(yù)處理組E-cadherin表達(dá)相對(duì)增加，α-SMA及p-p38MAPK表達(dá)相對(duì)減少，p38MAPK活性減弱(P<0.05)，p38MAPK的表達(dá)無(wú)顯著性差異；與ET-1組相比，BQ123預(yù)處理組E-cadherin表達(dá)相對(duì)增加，α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK表達(dá)相對(duì)減少，p38MAPK活性減弱(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表達(dá)和p38MAPK磷酸化水平

討 論

近年來(lái)，TEMT與RIF的關(guān)系是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，盡管TEMT 在RIF中的作用存在爭(zhēng)議[3]，但是越來(lái)越多的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型證實(shí)了作為肌成纖維細(xì)胞(MyoF)的重要來(lái)源的TEMT具有促進(jìn)RIF發(fā)生、發(fā)展的作用。

ET-1是已知作用最強(qiáng)和效應(yīng)最持久的內(nèi)源性血管收縮劑，除了改變血流動(dòng)力學(xué)作用外，還是參與各種慢性腎臟疾病RIF重要的效應(yīng)分子[4-6]。腎臟的固有細(xì)胞均可產(chǎn)生ET-1，其中腎小管上皮細(xì)胞還可通過(guò)自分泌和旁分泌ET-1導(dǎo)致RIF。國(guó)外學(xué)者在研究卵巢癌的發(fā)生、肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)ET-1具有促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用[7,8]，而ET-1是否具有誘導(dǎo)TEMT的作用目前尚未研究。E-cadherin是腎小管上皮細(xì)胞間緊密連接的重要成分，在保持細(xì)胞完整性中起重要作用，是上皮細(xì)胞特異蛋白之一。細(xì)胞間緊密連接破壞是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化發(fā)生的關(guān)鍵步驟之一，抑制E-cadherin，可促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[9]。α-SMA是具有收縮功能的細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)，是MyoF的標(biāo)志蛋白。α-SMA在正常的腎小管上皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)，在轉(zhuǎn)分化過(guò)程中表達(dá)增加，是上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ET-1刺激細(xì)胞使其發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，由鵝卵石樣變成梭形，而內(nèi)皮素A受體拮抗劑BQ123預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞的梭形改變明顯減弱。此外陰性對(duì)照組表達(dá)E-cadherin，而幾乎不表達(dá)α-SMA，應(yīng)用ET-1刺激腎小管上皮細(xì)胞后，E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)增多，且呈濃度及時(shí)間依賴性，表明腎小管上皮細(xì)胞在ET-1的作用下發(fā)生了由上皮細(xì)胞表型向MyoF表型轉(zhuǎn)變，而BQ123能顯著抑制ET-1引起的上述效應(yīng)，提示ET-1可誘導(dǎo)TEMT，因此ET-1的促RIF作用機(jī)制之一可能是通過(guò)ET-1誘導(dǎo)TEMT實(shí)現(xiàn)的。

p38MAPK作為MAPK家族中的一員，是細(xì)胞外信號(hào)刺激引細(xì)胞核反應(yīng)的共同通路，它通過(guò)影響基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，如細(xì)胞的存活、分化及凋亡[10]。Stambe等[11]發(fā)現(xiàn)p38MAPK可能作為TGF-β1的下游信號(hào)分子在RIF中發(fā)揮重要作用。而在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠RIF動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)p38MAPK可能參與了腎小管間質(zhì)纖維化過(guò)程[12]。Lv等[13]應(yīng)用siRNA沉默p38MAPK，能顯著減弱高糖誘導(dǎo)TEMT。這些研究提示p38MAPK信號(hào)通路與RIF及上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化密切相關(guān)。ET-1與其受體結(jié)合后能激活多種信號(hào)途徑，如磷脂酶C、絲氨酸/蘇氨酸激酶、p38MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)等從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效，如有研究發(fā)現(xiàn)ET-1能激活腎小球系膜細(xì)胞p38MAPK，進(jìn)而使ECM合成增多[14,15]。p38MAPK作為ET-1下游的信號(hào)分子，能否介導(dǎo)ET-1誘導(dǎo)的TEMT，為了進(jìn)一步明確ET-1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化過(guò)程中所涉及的信號(hào)通路，我們應(yīng)用BQ123和p38MAPK特異性抑制劑SB203580干預(yù)ET-1刺激的腎小管上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ET-1能夠上調(diào)p-p38MAPK蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)p38MAPK活性，而用BQ123預(yù)處理后，p-p38MAPK蛋白的表達(dá)減少，p38MAPK活性減弱，表明ET-1能激活p38MAPK信號(hào)通路。此外應(yīng)用SB203580能明顯抑制ET-1誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)減少，E-cadherin表達(dá)增多，說(shuō)明 p38MAPK信號(hào)通路可能參與ET-1誘導(dǎo)的TEMT過(guò)程。陳興無(wú)等[16]觀察人氣管上皮下成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程也發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號(hào)通路可介導(dǎo)ET-1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善了ET-1致病的作用機(jī)制，ET-1可能通過(guò)激活腎小管上皮細(xì)胞p38MAPK通路，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)α-SMA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)TEMT。因此一定程度抑制ET-1誘導(dǎo)的TEMT作用，可能是防治RIF的新途徑。

1 肖 舟,陳 晨,李曉照,等.冬蟲夏草抑制ET-1對(duì)糖尿病腎病大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012,13(12):1082-1085.

2 胡楊青,顏偉健,張 馳.內(nèi)皮素-1 對(duì)高糖溶液培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.臨床腎臟病雜志,2012,11(12):561-563.

3 Carew RM,Wang B,Kantharidis P.The role of EMT in renal fibrosis.Cell Tissue Res,2012,347(1):103-116.

4 Maixnerová D,Merta M,Reiterová J,et al.The influence of three endothelin-1 polymorphisms on the progression of IgA nephropathy.Folia Biol (Praha),2007,53(1):27-32.

5 Chang MY,Ong AC.Endothelin in polycystic kidney disease.Contrib Nephrol,2011,172:200-209.

6 Tang L,Yi R,Yang B,et al.Valsartan inhibited HIF-1α pathway and attenuated renal interstitial fibrosis in streptozotocin-diabetic rats.Diabetes Res Clin Pract,2012,97(1):125-131.

7 Rosanò L,Spinella F,Di Castro V,et al.Endothelin-1 promotes epithelial-to-mesenchymal transition in human ovarian cancer cells.Cancer Res,2005,65(24):11649-11657.

8 Jain R,Shaul PW,Borok Z,et al.Endothelin-1 induces alveolar epithelial-mesenchymal transition through endothelin type A receptor-mediated production of TGF-beta1.Am J Respir Cell Mol Biol,2007,37(1):38-47.

9 Yang YL,Ju HZ,Liu SF,et al.BMP-2 suppresses renal interstitial fibrosis by regulating epithelial-mesenchymal transition.J Cell Biochem,2011,112(9):2558-2565.

10 高振芹,胡永斌,周建華.MAPK 信號(hào)通路與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型.國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2009,29(4):303-306.

11 Stambe C,Atkins RC,Tesch GH,et al.The role of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in renal fibrosis.J Am Soc Nephrol,2004,15(2):370-379.

12 阮穎新,林 珊,宋鴻濤,等.單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中p38MAPK表達(dá)與細(xì)胞凋亡.中國(guó)病理生理雜志,2008,24(4):749-754.

13 Lv ZM,Wang Q,Wan Q,et al.The role of the p38 MAPK signaling pathway in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human renal tubular epithelial cells.PLoS One,2011,6(7):e22806.

14 Tsiani E,Lekas P,Fantus IG,et al.High glucose-enhanced activation of mesangial cell p38 MAPK by ET-1,ANG II,and platelet-derived growth factor.Am J Physiol Endocrinol Metab,2002,282(1):E161-E169.

15 Fang S,Jin Y,Zheng H,et al.High glucose condition upregulated Txnip expression level in rat mesangial cells through ROS/MEK/MAPK pathway.Mol Cell Biochem,2011,347(1-2):175-182.

16 陳興無(wú),徐 軍.內(nèi)皮素在誘導(dǎo)人氣管上皮下成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.中國(guó)病理生理雜志,2007,23(6):1125-1129.