趙德喜，熊 壯，王 健

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021)

腦水腫是ICH后繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素之一。本實(shí)驗(yàn)觀察大鼠ICH模型經(jīng)腦出血方干預(yù)后腦水含量變化，并采用免疫組化技術(shù)觀察各組MMP-2/MMP-9表達(dá)的情況。探討ICH后腦水腫的發(fā)生機(jī)制及腦出血方的作用機(jī)理，進(jìn)一步闡釋出血性腦卒中“髓虛毒損”病機(jī)核心的科學(xué)內(nèi)涵，為破血化瘀填精補(bǔ)髓法治療ICH提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康Wistar大鼠128只(由吉林大學(xué)藥學(xué)院提供),雌雄各半，鼠齡3～4個月，體質(zhì)量250～330 g。隨機(jī)選擇8只做正常對照組，24只為假手術(shù)組，其余大鼠制備ICH模型。造模后將大鼠放回籠中飼養(yǎng),自由活動及飲食。將造模成功大鼠隨機(jī)分為ICH模型組、腦出血方低、中、高劑量組各24只。

1.2 儀器 腦立體定位儀(美國STOELTING公司)；手持式牙科鉆(上海齒科醫(yī)械廠);微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)；生物組織包埋機(jī)(天津航空機(jī)電公司);靜脈留置針(小蝶型，24 G)等。

1.3 藥品與試劑 腦出血方藥物組成：生蒲黃15 g，水蛭8 g，虻蟲5 g，生大黃10 g，瓜蔞20 g，三七10 g，龜板膠10 g，石菖蒲15 g(以上藥物購自長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)。按傳統(tǒng)方法煎煮，在恒溫水槽中濃縮成1 mL含原生藥0.465 g的湯劑，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MMP-2、MMP-9一抗均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。SP(Streptavidin/Peroxidase)免疫組化染色試劑盒組成，試劑A：內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑；試劑B：10%正常非免疫動物血清；試劑C:生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(第二抗體)；試劑D：鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，購于福建邁新生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購于福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.4 給藥方法 術(shù)后3 h低、中、高劑量組分別給予中藥湯劑0.5、1和2 mL/(100 g·d)灌胃，假手術(shù)組和模型組給予1 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，正常組自由飲食。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物模型的建立 參照張朋奇等[1]報道的方法建立大鼠ICH模型。造模完成后注射用青霉素鈉6萬u肌肉注射，連續(xù)用4 d。假手術(shù)組操作過程同上，只進(jìn)針不注血。

2.2 神經(jīng)功能缺失評分 參照Zea-longa[3]的5分制方法進(jìn)行。所有大鼠在麻醉清醒后即評定神經(jīng)功能缺損程度，1次/d，直至斷頭處死為止。

2.3 標(biāo)本處理 相應(yīng)時間點(diǎn)過量麻醉大鼠，迅速開胸，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注固定，斷頭取腦，距針孔前后約2 mm位置處冠狀切開，放入4%多聚甲醛中固定保存。

2.4 腦水含量測定 腦水含量采用干濕重法測定[4]。BWC(%)=(濕重-干重)÷濕重×100%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HE染色結(jié)果 正常組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞胞漿、核染色均勻，核仁清楚，核膜完整，神經(jīng)纖維束正常。假手術(shù)組大鼠腦組織HE染色:僅沿針道處可見數(shù)目極少的壞死細(xì)胞。ICH模型組及腦出血方高、中、低劑量組術(shù)后大鼠腦組織HE染色:第1天可見血腫形成，神經(jīng)元及細(xì)胞間隙增寬，組織結(jié)構(gòu)疏松，并有少量炎癥細(xì)胞浸潤。第3天各組腦水腫程度達(dá)到高峰,大量炎癥細(xì)胞浸潤。第7天神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞腫脹及組織疏松明顯減輕,各時間點(diǎn)腦出血方高、中、低劑量組與ICH模型組比較腦水腫程度明顯減輕。

3.2 各組大鼠腦水含量的比較 見表1。

表1 各組不同時間腦水含量的變化(±s,n=24)

3.3 各組大鼠MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)的比較 見表2。

表2 各組不同時間MMP-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s,n=24)

3.4 各組大鼠MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)的比較 見表3。

4 討論

4.1 ICH后腦水腫的辨證論治 ICH后腦水腫的病機(jī)關(guān)鍵是“血瘀”，治療時要抓住祛除血腫這個關(guān)鍵點(diǎn)[6]。因此,任繼學(xué)提出了以破血化瘀為主的腦出血治療大法。在“髓虛毒損”病機(jī)理論指導(dǎo)下，腦出血方中加入填精補(bǔ)髓的藥物，使腦之氣街及血海得腦氣約束而氣機(jī)條暢，體現(xiàn)了標(biāo)本兼顧的原則。

表3 各組不同時間MMP-9蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較(±s,n=24)

4.2 破血化瘀填精補(bǔ)髓法對大鼠ICH后腦水含量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組在第1天血腫周圍既可見明顯腦水腫的發(fā)生，第3天達(dá)到高峰，7 d腦水含量已明顯下降，高劑量組減少腦水含量最為明顯，說明腦出血方具有明確的對抗ICH后腦水腫的作用。

4.3 破血化瘀填精補(bǔ)髓法對大鼠ICH后腦組織MMP-2/MMP-9表達(dá)的影響 MMPs是人體最主要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，MMP-2、MMP-9均是一組同源的。在ICH發(fā)生時,自身裂解、活化，破壞毛細(xì)血管外基質(zhì)，從而破壞血腦屏障的完整性，引起腦水腫等一系列病理反應(yīng)。本研究顯示正常組未見MMP-2/MMP-9陽性染色細(xì)胞表達(dá),假手術(shù)組僅見MMP-9陽性細(xì)胞的少量表達(dá)。模型組MMP-2陽性細(xì)胞在造模后1 d即發(fā)現(xiàn)MMP-2陽性細(xì)胞的明顯表達(dá),隨時間逐漸增多，低、中、高劑量組表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05或P<0.01)；而MMP-9陽性細(xì)胞第1天開始表達(dá)，在第3天達(dá)高峰，第7天明顯下降，高劑量組表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.01)。所以，腦出血方可能通過抑制MMP-2/MMP-9表達(dá)而減輕腦水腫。

[1]張朋奇,朱賢立,趙甲山,等.一種大鼠腦內(nèi)出血模型的建立與評價[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志,2005,10(1):33-35.

[2]諸葛啟釧.大鼠腦立體定位圖譜[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Gotoh O,Sano A,Koide T,et al.Isehemie brain edema following oeelusion of the middle cerebral artery in the rat[J].Stroke,1985,16(1):101-109.

[5]姚金文,趙德喜.出血性中風(fēng)早期應(yīng)用疏血通注射液驗(yàn)案分析[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,24(3):300-300.

[6]趙德喜,于蘭.破血化瘀法為主治療出血性腦卒中臨床研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,28(6):975.