楊濟(jì)洲，徐 林

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 骨科，北京 100700)

骨折愈合是骨科領(lǐng)域中研究較多的課題，中醫(yī)藥在治療骨折、促進(jìn)骨愈合方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，有其特有的優(yōu)勢(shì)。骨痛膏源自吉林省民間驗(yàn)方，在臨床應(yīng)用多年，療效確切，本實(shí)驗(yàn)以家兔骨缺損模型為觀察對(duì)象，以骨折愈合過程中BMP-2mRNA為研究對(duì)象?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 骨痛膏(由藏紅花、血竭、自然銅、三七、木香、米醋組成，長(zhǎng)春呈實(shí)健康實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)制備)，批準(zhǔn)文號(hào)：吉衛(wèi)健用字(2008)第12號(hào)。

1.1.2 動(dòng)物 選用健康、雄性、3月齡日本大耳白兔30只，體質(zhì)量：(2±0.5) kg，由中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)所動(dòng)物中心提供。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉，北京市化學(xué)試劑公司提供；DAB顯色試劑盒、AR1022，武漢博士德生物工程有限公司；BMP-2原位雜交檢測(cè)試劑盒，天津市灝洋生物制品科技有限公司；光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS BX51連接OLYMPUS DP70采集器(DP Controller采集軟件)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將30只成年雄性日本大耳白兔隨機(jī)分成2組，分別為國新牌骨痛膏外用藥組和空白對(duì)照組，每組15只。再將每組15只隨機(jī)分成3個(gè)亞組，即第1周取標(biāo)本組(A組)、第2周取標(biāo)本組(B組)、第4周取標(biāo)本組(C組)，每次參加檢測(cè)的動(dòng)物：10只(20個(gè)橈骨標(biāo)本)。

1.2.2 動(dòng)物模型制作方法 30只日本大耳白兔均以手術(shù)造成雙橈骨中段寬約3 mm、深達(dá)髓腔的缺損骨折模型。取兔稱重，以3%戊巴比妥鈉，按30 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，將兔仰臥于臺(tái)上，前肢剪毛，碘伏消毒，鋪無菌孔巾，前肢中段橈骨背側(cè)行2 cm縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織，暴露橈骨中段，于旋前圓肌止點(diǎn)下切開骨膜，剝離1 cm左右，用咬骨鉗造成寬約3 mm、深達(dá)髓腔的骨質(zhì)缺損，注意勿損傷神經(jīng)、血管，生理鹽水沖洗，逐層縫合皮下組織及皮膚。用藥組外敷骨痛膏，所有模型兔均以石膏夾板外固定。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素以預(yù)防感染，40萬u/次，2次/d。

1.2.3 給藥方法 造模成功后即開始對(duì)實(shí)驗(yàn)組外用骨痛膏，將藥涂抹于透氣棉布上,環(huán)繞橈骨(手術(shù)切口0.5 cm以內(nèi)不用)外敷骨折處,外用石膏夾板固定，每2 d換1次藥?？瞻讓?duì)照組予石膏夾板外固定。

1.2.4 標(biāo)本取材 兔耳緣靜脈注入空氣約2 mL，將實(shí)驗(yàn)兔空氣栓塞致死，造模后第7天處死A組，第14天處死B組，第28天處死C組。自肘關(guān)節(jié)離斷，取雙側(cè)前肢送檢。

1.2.5 觀察指標(biāo) 1)原位雜交染色觀察及分析：取包括骨折斷端及其周圍軟骨痂約1 cm。標(biāo)本置入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4的多聚甲醛中固定48 h后，再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為125 g/L EDTA-Na24 ℃下徹底脫鈣，每4 d更換脫鈣液1次。待針可刺入骨皮質(zhì)時(shí)停止脫鈣,隨后用石蠟包埋，制備6 μm厚度切片,切片經(jīng)脫蠟水化后，經(jīng)山羊血清封閉內(nèi)源酶，按原位雜交操作規(guī)范及試劑盒說明進(jìn)行試驗(yàn)。原位雜交設(shè)空白對(duì)照,平行操作，標(biāo)記探針均用PBS緩沖液替代。陽性細(xì)胞漿和(或)膜著色呈棕黃色。以每個(gè)切片6個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)之平均數(shù)代表該切片的陽性細(xì)胞數(shù)，6個(gè)視野的總MOD之平均數(shù)為該切片陽性細(xì)胞MOD值。用LEICA DM6000B病理圖像分析儀Leica Qwin Pro圖分析軟件對(duì)BMP-2mRNA染色面積測(cè)定，A、B、C各組進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 各組實(shí)驗(yàn)兔麻醉清醒后即能用前肢著地，處于正常的蹲伏狀態(tài),術(shù)后第1天即能在籠中自如活動(dòng)，并能正常取食及飲水。各組實(shí)驗(yàn)兔傷口無紅腫、滲液，呈一期愈合。肉眼觀察術(shù)肢局部組織情況，外用藥組血腫機(jī)化、表面骨痂出現(xiàn)較早且明顯。

2.2 原位雜交染色觀察及分析 術(shù)后第1周，用藥組即出現(xiàn)纖維性骨痂并出現(xiàn)BMP-2mRNA擴(kuò)增表達(dá)，在外骨痂一些成熟軟骨細(xì)胞中亦可見BMP-2mRNA擴(kuò)增表達(dá),對(duì)照組未見骨痂，在成纖維細(xì)胞中未見明顯陽性染色細(xì)胞。術(shù)后第2周,用藥組可見大量BMP-2mRNA陽性染色細(xì)胞，陽性表達(dá)集中在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)、間質(zhì)細(xì)胞等，對(duì)照組軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及周圍基質(zhì)均呈弱陽性表達(dá)，且著色明顯淺于用藥組。術(shù)后第4周陽性細(xì)胞數(shù)量及范圍明顯下降，骨小梁排列緊密，編織骨已向板層骨轉(zhuǎn)化，陽性染色程度明顯減弱，在軟骨細(xì)胞中仍有少量表達(dá)，成熟的骨細(xì)胞未見明顯陽性染色，但著色較淺，骨小梁排列稀疏，可見著色的軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。在全部切片中骨痂局部BMP-2mRNA濃度最高，正常骨組織未見陽性染色?？v向比較，2組術(shù)后染色均呈先強(qiáng)后弱，術(shù)后染色高峰出現(xiàn)在術(shù)后2周。橫向比較，用藥組陽性染色均較對(duì)照組強(qiáng)，尤其在第1、2周。這與免疫組化染色結(jié)果完全吻合。陽性顆粒平均光密度值和陽性產(chǎn)物平均積分光密度比較，見表1。

表1 不同觀察時(shí)間骨痂中BMP-2 表達(dá)光密度均值(±s)

3 討論

中醫(yī)外治法治療骨折有著悠久的歷史，早在漢代的《居延漢簡(jiǎn)》中就記載了漢代軍醫(yī)以膏藥為主治療各種創(chuàng)傷的方藥和方法。清代名醫(yī)吳機(jī)師提出“凡病多從外入，故醫(yī)有外治法，經(jīng)文外取內(nèi)取并列，未嘗教人專用內(nèi)治也?！焙汀巴庵沃砑磧?nèi)治之理，外治之藥亦即內(nèi)治之藥，所異者法爾”的觀點(diǎn)為后世骨傷醫(yī)家所推崇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨折愈合的過程就是“瘀祛、新生、骨合”的過程。骨痛膏是由藏紅花、血竭、自然銅、三七、木香、米醋調(diào)制而成。方中藏紅花、血竭、三七活血化瘀、消腫止痛。木香行氣止痛。自然銅散瘀止痛、接骨續(xù)筋，《本草經(jīng)疏》中記載“自然銅乃入血行血，續(xù)筋接骨之要藥也”。米醋性寒味酸，具有軟堅(jiān)散結(jié)作用，作為載體和滲透劑與他藥合用可增加活血止痛作用[1]。諸藥合用共奏行氣活血、接骨續(xù)筋之功。故從理論上講在骨折的治療中，骨痛膏完全符合中醫(yī)骨折外治的治則。大體觀察藥組骨痂出現(xiàn)時(shí)間明顯早于對(duì)照組、骨痂量明顯多于對(duì)照組，可以早期提供骨缺損區(qū)的穩(wěn)定，臨床可以早期開始行功能鍛煉，減少一些并發(fā)癥的出現(xiàn)。4周時(shí)用藥組骨愈合情況亦明顯優(yōu)與對(duì)照組,說明外用骨痛膏可以明顯促進(jìn)骨愈合。本實(shí)驗(yàn)BMP-2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平呈動(dòng)態(tài)變化,即骨折后開始升高,2周左右達(dá)到高峰,以后逐漸下降,這與王鵬程等[2]的研究近似。施萊[3]研究認(rèn)為，中藥對(duì)骨形成的影響可能通過介導(dǎo)BMP而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨痛膏可明顯促進(jìn)BMP-2mRNA的表達(dá),促進(jìn)骨折的愈合，說明外用中藥可以明顯促進(jìn)骨愈合。目前，外用中藥在骨愈合方面的研究鮮見，但在民間應(yīng)用廣泛，對(duì)于骨痛膏中的透皮機(jī)理及具體有效成分以及促進(jìn)骨愈合的具體機(jī)制等方面還有待研究。

[1]王靜,毛春芹,陸兔林,等.中藥醋制法研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2009,16(1):99-101.

[2]王鵬程,張英澤,劉勇謙,等.內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白在骨修復(fù)中的作用[J].中國矯形外科雜志,1999,6(5):348.

[3]施萊.中藥加速骨折愈合機(jī)理的研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,26(4):601.