周大亮, 于麗芳, 魏 林*, 阮圣斐, 趙學(xué)忠, 睢大員, 于小風(fēng), 曲紹春,江一川

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曲美他嗪后處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡的保護性作用

周大亮1, 于麗芳2, 魏 林1*, 阮圣斐3, 趙學(xué)忠3, 睢大員4, 于小風(fēng)4, 曲紹春4,江一川4

（1哈爾濱市第一醫(yī)院心內(nèi)一科, 哈爾濱 150001;2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科, 哈爾濱 150040;3吉林大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科, 長春 130021;4吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室, 長春 130021）

研究曲美他嗪后處理對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響。實驗大鼠40只，隨機分為5組：假手術(shù)組（＝8）、再灌注損傷模型組（＝8）、曲美他嗪低劑量組（10mg/kg，＝8）、曲美他嗪高劑量組（20mg/kg，＝8），后處理組（＝8）。制作再灌注損傷模型后，觀察各組大鼠心肌梗死面積、Bcl2/bax蛋白表達以及電子顯微鏡下心肌組織切片觀察。（1）各組大鼠心肌梗死面積測定：假手術(shù)組未見梗死，其余各組大鼠心肌組織不同程度梗死，以后處理組及曲美他嗪高劑量組最輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。（2）各組大鼠Bcl2/Bax蛋白表達比較：在模型組中Bax蛋白強陽性表達，表現(xiàn)為軟件分析結(jié)果灰度值最低。而曲美他嗪高劑量組及后處理組灰度值較模型組比較灰度值明顯增大（＜0.01）。Bcl2蛋白在模型組中表達較少，在曲美他嗪高劑量組中及后處理組中明顯表達，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。（3）電子顯微鏡下觀察：除假手術(shù)組大鼠外，各組大鼠均有不同程度損傷及細胞凋亡，后處理組及曲美他嗪高劑量組損傷較輕。高劑量曲美他嗪（20mg/kg）對大鼠心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡有抑制作用。

曲美他嗪; 再灌注損傷; 缺血后處理; 細胞凋亡; 大鼠

隨著心臟介入技術(shù)的不斷發(fā)展，眾多的心肌梗死患者得以存活，但人們發(fā)現(xiàn)在開通梗死相關(guān)動脈后將出現(xiàn)心肌損傷加重，這稱之為缺血再灌注損傷，而近些年研究細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的一個重要環(huán)節(jié)[1,2]。通過藥物來控制心肌缺血再灌注損傷一直是人們研究的主要方向，曲美他嗪是目前歐洲心臟學(xué)會專家組建議中惟一提到具有潛在的抗心絞痛的代謝藥物，具有抗缺血、抗氧自由基作用[3,4]。本實驗通過再灌注后給予再灌注大鼠不同劑量的曲美他嗪，來探討曲美他嗪后處理對心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用Wistar成年健康大鼠，體質(zhì)量180～220g，雌雄各半。由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。制作缺血再灌注損傷模型后，將Wistar大鼠隨機分為再灌注損傷組，缺血后處理組，曲美他嗪高劑量組（20mg/kg），曲美他嗪低劑量組（10mg/kg），每組8只。另取Wistar成年健康大鼠8只為假手術(shù)組。此前所有動物已在實驗室適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 實驗方法

1.2.1 缺血再灌注模型制備 將Wistar大鼠乙醚吸入麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺，剪去胸前鼠毛，先用縫線在開胸部位做一荷包，自左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找到冠狀動脈左前降支，于左心耳下2～3mm處用0號縫線結(jié)扎冠狀動脈系一活結(jié)。（1）再灌注損傷組：缺血30min后，恢復(fù)冠狀動脈血流120min；（2）缺血后處理組：缺血30min，再灌30s、缺血30s反復(fù)3次，再灌120min；（3）曲美他嗪高劑量組（20mg/kg）：缺血30min同時給予曲美他嗪藥物，再灌120min；（4）曲美他嗪低劑量組（10mg/kg）：缺血30min同時給予曲美他嗪藥物，再灌120min。假手術(shù)組大鼠僅置縫線而不結(jié)扎冠狀動脈。

1.2.2 給藥方法 各組用藥劑量均參照人與大鼠體表面積換算[5]。曲美他嗪高劑量組：20mg/kg灌胃，缺血30min同時給予。曲美他嗪低劑量組：10mg/kg灌胃，缺血30min同時給予。假手術(shù)組、后處理模型組均灌胃等量生理鹽水注射液，給予時間及途徑同上。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 梗死面積測量方法 每組取8只大鼠取血后剖取心臟，用生理鹽水洗凈心腔內(nèi)積血，去掉心房組織及脂肪，稱重，將左心室心肌橫切4～5片，然后浸入氯化硝基四氮唑藍（NB-T）磷酸緩沖液中，置37℃恒溫水浴，待染色完全后取出，正常組織染色，缺血組織不染色。切下缺血心肌稱重，用缺血心肌與左心室濕重的百分比計算梗死范圍。

1.3.2 免疫組化測定Bcl2，Bax表達 采用SP法，實驗步驟按照試劑盒說明。免疫組化結(jié)果分析采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件，結(jié)果為灰度值，灰度值越大陽性越低，灰度值越小陽性越高。照片均為放大200倍。

1.3.3 細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 電鏡觀察：取左前壁上方5mm處部分心肌，立即投入預(yù)冷的戊二醛溶液中初固定4h，PBS漂洗30min×3次，1%鵝酸后固定3h，同樣方法漂洗3次，以上實驗在4℃下操作。50%乙醇脫水10min，4%醋酸鈾染色過夜，90%乙醇10min，100%乙醇30min×3次，再置于100%乙醇加環(huán)氧丙烷1份中5min×3次，環(huán)氧樹脂618包埋液1份加環(huán)氧丙烷1份浸透1～2h，包埋液37℃浸透2～3h，包埋聚合，37℃過夜，60℃24h，整修包埋頭。用半薄切片定位后，進行超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較用方差分析和檢驗。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠梗死面積比較

假手術(shù)組未見梗死，其余各組大鼠心肌組織不同程度梗死，以后處理組及曲美他嗪高劑量組梗死程度最輕（＜0.05，＜0.01；表1，圖1）。

2.2 Bcl2和Bax蛋白的表達

表2，圖2，圖3結(jié)果表明，在模型組中Bax蛋白強陽性表達，表現(xiàn)為軟件分析結(jié)果灰度值最低（＜0.01）。而曲美他嗪高劑量組及后處理組灰度值較模型組比較灰度值明顯增大（＜0.05）。而Bcl2蛋白在模型組中表達較少（＜0.01），在曲美他嗪高劑量組中及后處理組中明顯表達，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。

2.3 大鼠心肌組織電子顯微鏡下觀察

假手術(shù)組心肌肌原纖維排列整齊，肌絲清晰；線粒體結(jié)構(gòu)完整，無腫脹。細胞核、核仁顯示良好（圖4A）。再灌注模型組心肌肌原纖維排列較紊亂，胞質(zhì)基質(zhì)局部空化，肌絲部分溶解；嵴斷裂，線粒體腫脹，核固縮（圖4B）。曲美他嗪低劑量組肌絲束上部分肌節(jié)可見，肌絲明顯減少，溶解、消失，胞質(zhì)基質(zhì)空化，線粒體呈小圓形固縮狀（圖4C）。曲美他嗪高劑量組細胞核略不規(guī)則形，肌絲束減少，其上肌節(jié)可辨，線粒體呈小圓形（圖4D）。后處理組肌絲束上部分肌節(jié)結(jié)構(gòu)清楚，部分肌絲局部溶解、斷裂，基質(zhì)空化（圖4E）。由此可見，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠心肌均受到心肌梗死后再灌注損傷，其中以曲美他嗪高劑量組及后處理組損傷程度較輕。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較

Compared with MIRI model group,*＜0.05,**＜0.01

表2 各組大鼠Bcl2, Bax蛋白表達灰度值比較

Compared with sham-operation group,*＜0.05,**＜0.01; compared with MIRI model group,#＜0.05

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機制尚未完全明確，多項基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果顯示，心肌代謝障礙，氧自由基產(chǎn)生過多、鈣超載、中性粒細胞聚積、內(nèi)皮功能受損、細胞凋亡等均可能直接參與心肌缺血再灌注損傷[6,7]。

2003年Zhao等[8]提出了缺血后處理的方法；之后，較多的臨床實驗證實這種經(jīng)典的后處理方法對缺血再灌注心肌有明確保護作用。由于后處理的方法不易操作，近年來人們逐漸嘗試在心肌再灌注開始時應(yīng)用某些藥物以模擬后處理機制，并取得了相同或相似的心肌保護作用[9]。

筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比各組大鼠心肌都存在不同程度的梗死面積，在電子顯微鏡下也呈現(xiàn)出不同程度的損害，說明除假手術(shù)組外其余各組大鼠出現(xiàn)了心肌梗死后缺血再灌注損傷，提示梗死再灌注模型制作成功。更重要的是筆者發(fā)現(xiàn)了與再灌注模型組相比，曲美他嗪高劑量組及后處理組可以明顯減少心肌梗死面積，而且電子顯微鏡下?lián)p傷亦較再灌注損傷組輕。因此提示曲美他嗪高劑量組與后處理組產(chǎn)生了相似的心肌保護作用。

圖1 心肌TTC染色結(jié)果

Figure 1 Results of myocaridial staining (TTC staining)

A: Sham-operation group; B: MIRI model group; C: Trimetazidine(10mg/kg) group; D:Trimetazidine(20mg/kg) group; E:Post-conditioning group

圖2 Bcl2蛋白的表達

Figure 2 Expression of Bcl2 protein (×200)

A:Sham-operation group; B:MIRI model group; C: Trimetazidine（10mg/kg）group; D: Trimetazidine（20mg/kg）group; E: Post-conditioning group

圖3 Bax蛋白的表達

Figure 3 Expression of Bax protein(×200)

A:Sham-operation group; B:MIRI model group; C: Trimetazidine（10mg/kg）group; D: Trimetazidine（20mg/kg）group; E: Post-conditioning group

圖4 大鼠心肌組織透射電子顯微鏡下觀察

Figure 4 Myocardium of rats under transmission electron microscope(×10000)

心肌缺血再灌注損傷后，細胞凋亡機制將激活，大量的細胞凋亡將導(dǎo)致心肌進一步壞死。細胞凋亡是有許多基因參與的細胞新陳代謝過程，機制非常復(fù)雜，其中Bcl2基因家族是目前較公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因[10]，Bcl2基因產(chǎn)物主要位于線粒體膜，核膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，Bcl2基因可抑制許多因素引起的細胞凋亡，也成為抗凋亡蛋白。Bax基因?qū)儆贐cl2基因家族成員，其功能與Bcl2基因相反，為促凋亡蛋白[10,11]。最近研究結(jié)果表明，Bcl2/bax比值可反映Bcl2和Bax在細胞凋亡中的作用，若Bcl2/bax比值升高，則抑制細胞凋亡，反之則促進細胞凋亡。我們的實驗結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注期間，曲美他嗪高劑量組、后處理組與缺血再灌注組大鼠相比Bcl2/Bax比值明顯升高，提示這兩組經(jīng)過治療后均抑制了缺血細胞凋亡的進一步發(fā)展。

總之，在成功復(fù)制缺血再灌注損傷模型后，給予曲美他嗪后處理，發(fā)現(xiàn)曲美他嗪對心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡具有一定的抑制作用，但其機制尚不完全明晰，有待于進一步研究。

[1] Zhao ZQ, Makamura M, Wang NP,. Reperfusion induces myocardial apoptotic cell death[J]. Cardiovasc Res, 2000, 45(3): 651?660.

[2] Freude B, Master TN, Robicsek F,. Apoptosis is initiated by myocardial ischemia and executed during reperfusion[J]. J Am Coll Cardiol, 2000, 32(2): 197?208.

[3] Dhote V, Balaraman R. Anti-oxidant activity mediated neuroprotective potential of trimetazidine on focal cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2008, 35(5?6): 630?637.

[4] Jayle C, Favreau F, Zhang K,. Comparison of protective effects of trimetazidine against experimental warm ischemia of different durations: early and long-term effects in a pig kidney model[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 292(3): F1082?1093.

[5] 苗明三. 實驗動物和動物實驗技術(shù)[M]. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 1997: 142?145.

[6] Buja LM. Myocardial ischemia and reperfusion injury[J]. Cardiovasc Pathol, 2005, 14(4): 170?175.

[7] Hoffman JW Jr, Gilber TB, Poston RS,. Myocardial reperfusion injury: etiology, mechanisms, and therapies[J]. J Extra corpor Technol, 2004, 36(4): 391?411.

[8] Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME,. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 285(2): H579?588.

[9] Burley DS, Baxter GF. Pharmacological targets revealed by myocardial postconditioning[J]. Curr Opin Pharmacol, 2009, 9(2): 177?188.

[10] Kumar P, Coltas IK, Kumar B,. Bcl-2 protects endothelial cells against gamma-radiationa Raf-MEK-ERK-survivin signaling pathway that is independent of cytochrome c release[J]. Cancer Res, 2007, 67(3): 1193?1202.

[11] Lalier L, Cartron PF, Juin P,. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J]. Apoptosis, 2007, 12(5): 887?896.

（編輯: 周宇紅）

Trimetazidine post-conditioning protects rats from cardiocyte apoptosis after myocardial ischemia/reperfusion injury

ZHOU Da-Liang1, YU Li-Fang2, WEI Lin1*, RUAN Sheng-Fei3, ZHAO Xue-Zhong3, SUI Da-Yuan4, YU Xiao-Feng4, QU Shao-Chun4, JIANG Yi-Chuan4

(1First Department of Cardiology, First Hospital of Harbin, Harbin 150001, China;2Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China;3Department of Cardiology, First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China;4Department of Pharmacology, College of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)

To determine the protective effect of trimetazidine post-conditioning on cell apoptosis in rats induced by myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI).Forty healthy adult Wistar rats were randomly assigned to sham-operation group, MIRI group, ischemic post-conditioning group and two trimetazidinee treatment groups (10 and 20mg/kg), with 8 rats in each group. MIRI model was established by ligation of coronary artery for 30min followed by 120min reperfusion. The rats in ischemic post-conditioning group were given another three times of ischemia/reperfusion for 30s at the interval of 30min ischemia and 120min reperfusion. Trimetazidinee or normal saline at same volume was given intragastrically to corresponding rats during the 30min ischemia. After MIRI, myocardial infarct area was measured, the expression of Bcl2 and bax was detected by immunohistochemical assays, and the myocardiocyte ultrastructure was observed with transmission electron microscopy.(1) Myocardial infarct area. No infarct was seen in the sham-operation group, but infarcts with different severities were found in the other groups, with those in the ischemic post-conditioning group and 20mg/kg trimetazidinee treatment group mildest (＜0.01). (2) The expression of Bcl2/bax protein. The expression of Bax was very strong, while that of Bcl2 was very weak in the MIRI group, when compared with 20mg/kg trimetazidine group and ischemic post-conditioning group (both＜0.01). (3) Morphology of cardiac muscle. Besides sham-operation group, ischemia/reperfusion injury and cardiocyte apoptosis were observed in other groups, with those in the ischemic post-conditioning group and 20mg/kg trimetazidinee treatment group most mildly.Trimetazidine of 20mg/kg inhibits cardiocyte apoptosis in rats after MIRI.

trimetazidine; ischemia/reperfusion injury; ischemic post-conditioning; apoptosis; rats

(2011RFQYS106).

R364.1+7

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00180

2013?03?14;

2013?07?19

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才研究專項基金（2011RFQYS106）

魏 林, E-mail: weilin1964@163.com