丁 超, 郭 潔, 王冬梅, 李 潔, 于 敏, 彭育紅

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重組人腦鈉尿肽對(duì)兔缺血/再灌注后心室肌細(xì)胞鈉離子通道電流的影響

丁 超*, 郭 潔, 王冬梅, 李 潔, 于 敏, 彭育紅

（解放軍白求恩國際和平醫(yī)院心血管內(nèi)科, 石家莊 050082）

研究重組人腦鈉尿肽（rhBNP）對(duì)兔在體缺血/再灌注（I/R）后心室肌細(xì)胞鈉離子通道電流（Na）的影響，探討rhBNP拮抗再灌注心律失常的細(xì)胞學(xué)離子機(jī)制。新西蘭大耳白兔45只隨機(jī)分為3組（＝15）：I/R損傷組（I/R組，缺血30min后再灌注120min）；rhBNP治療組[rhBNP組，再灌注后經(jīng)動(dòng)物耳緣靜脈注射rhBNP 0.06μg/（kg·min）]；假手術(shù)對(duì)照組（CON組，只開胸不結(jié)扎血管）。采用酶解的方法分離缺血部位心室肌外膜單個(gè)心室肌細(xì)胞，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄INa。CON組、I/R組、rhBNP組Na密度峰值（-30mV）分別為（-42.78±5.48，＝16），（-22.46±5.32，＝12），（-37.82±5.45，＝15）pA/pF，I/R組較CON組明顯下降（＜0.01），rhBNP組較I/R組明顯升高（＜0.01）。I/R后心肌Na明顯下降，給予rhBNP可使下降的Na上調(diào)，提示rhBNP可減輕或逆轉(zhuǎn)這種電重構(gòu)。

重組人腦鈉尿肽; 缺血/再灌注; 膜片鉗; 離子通道

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneuos coronary intervention，PCI）技術(shù)帶來的再灌注損傷，直接影響患者的預(yù)后，缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）心律失常以室性心律失常最常見, 包括室性期前收縮、室性心動(dòng)過速（室速）以及室性纖顫（室顫），心律失常是I/R期間患者猝死的最主要原因之一[1]。重組人腦鈉尿肽（recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP）可以拮抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，抑制心肌重構(gòu)[2,3]。rhBNP對(duì)心肌細(xì)胞是否有電生理學(xué)效應(yīng)，目前的研究報(bào)道不多。本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究rhBNP對(duì)I/R后兔心室肌細(xì)胞跨膜鈉離子通道電流（sodium current，Na）的影響，探討rhBNP拮抗再灌注心律失常的細(xì)胞學(xué)離子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康新西蘭大耳白兔45只，體質(zhì)量2.5～3.0kg，雌雄不拘，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組（每組15只）：假手術(shù)對(duì)照組（CON組），I/R損傷組(I/R組) 和rhBNP治療組（rhBNP組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸[4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1- erhanesulfonic acid，HEPES]，乙二醇雙（2-氨乙基醚）四乙酸[Ethylene glycol-bis（2-aminoethyl ether） -N，N，N'，N'-tetraacetic acid，EGTA]，4-氨基吡啶（4- aminopyridine，4-AP），膠原酶I購自Sigma公司。rhBNP（商品名新活素，0.5mg/支，成都諾迪康生物制藥有限公司生產(chǎn)）。按文獻(xiàn)[4]方法配置INa電極外液和INa電極內(nèi)液。

1.3 心肌I/R動(dòng)物模型建立

家兔采用2.5%硫噴妥鈉耳緣靜脈麻醉（1.0ml/kg）。剪開心包膜后，分離左冠狀動(dòng)脈前降支，用不銹鋼圓針帶6-0絲線穿過心肌淺層，絲線穿過一塑料管，結(jié)扎絲線使塑料管壓迫冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血，30min后，放松結(jié)扎線后行心肌再灌注120min，建成心肌I/R動(dòng)物模型[5]。CON組開胸后僅分離左冠狀動(dòng)脈前降支并穿線但不結(jié)扎，以排除開胸手術(shù)本身對(duì)心肌細(xì)胞電生理參數(shù)的影響。在I/R即刻，rhBNP組動(dòng)物經(jīng)耳緣靜脈注射rhBNP0.06μg/（kg·min），持續(xù)30min，CON組和I/R組動(dòng)物注射相同劑量的生理鹽水。

1.4 細(xì)胞分離

I/R模型建立并用藥后即處死動(dòng)物并分離細(xì)胞，采用酶解（膠原酶Ⅰ 0.4mg/ml，Sigma公司）方法[6]分離單個(gè)心室肌細(xì)胞。I/R組和rhBNP組細(xì)胞來源于左心室前壁梗死區(qū)，特征為此梗死區(qū)外膜變?yōu)榘咨咂瑺睿籆ON組細(xì)胞則取自左心室與梗死區(qū)相對(duì)應(yīng)的部位。

1.5 膜片鉗全細(xì)胞記錄

按文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行，脈沖信號(hào)經(jīng)EPC-9膜片鉗放大器（HEKA，德國）放大，并經(jīng)EPC-9轉(zhuǎn)換，用Pulse+Pulsefit軟件（HEKA，德國）收集、分析。電流幅值除以細(xì)胞膜電容所得即為電流密度（單位pA/pF）。從維持電位（holding potential，HP）-80mV，階躍+10mV，逐步除極到+60mV，刺激頻率0.5Hz，鉗制時(shí)間50ms。以不同鉗制電壓下的Na強(qiáng)度繪成電流-電壓（-）曲線。所有實(shí)驗(yàn)在室溫（25℃）下進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

圖1示3組細(xì)胞Na的-曲線，均在-60mV激活，-30mV達(dá)峰值，+40mV時(shí)反轉(zhuǎn)。I/R組與CON組相比，-曲線上移。rhBNP組與I/R組相比，-曲線下移，接近CON組。但I(xiàn)Na電壓依賴性不變，對(duì)激活電位、峰值電位、反轉(zhuǎn)電位及-曲線的形態(tài)軌跡均無影響。

圖1 3組細(xì)胞典型的INa形態(tài)曲線

Figure 1 RepresentativeNatraces recorded from myocytes of three groups

由圖2可見，CON組、I/R組、rhBNP組Na電流密度峰值（-30mV）分別為（-42.78±5.48，＝16），（-22.46±5.32，＝12），（-37.82±5.45，＝15) pA/pF。與CON組比較，I/R組Na明顯下降（＜0.01）；與I/R組比較，rhBNP組Na明顯升高（＜0.01）。rhBNP組與對(duì)照組Na差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

3 討 論

腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）是一種主要由心室肌分泌的循環(huán)激素。國外基礎(chǔ)及臨床研究結(jié)果表明：BNP可以擴(kuò)張機(jī)體動(dòng)靜脈血管，降低肺及外周血管阻力，提高心輸出量，降低容量負(fù)荷；并可以拮抗繼發(fā)性的腎素-血管緊張素系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，對(duì)抗其毒性作用，減少心肌梗死面積，改善患者的臨床和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[8-11]。 rhBNP是一種應(yīng)用生物重組技術(shù)生產(chǎn)的、與人類內(nèi)源性BNP等同的肽類物質(zhì)，已在2002年被美國食品及藥品管理署（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療急性失代償性心力衰竭。

圖2 rhBNP對(duì)缺血心肌細(xì)胞INaI-V曲線的影響

Figure 2 Effect of rhBNP onNacurrent-voltage relations in rabbit ischemic /reperfusion cardiomyocytes

再灌注心律失常是指缺血心肌部分或全部恢復(fù)血流灌注的過程中所發(fā)生的心律失常。這些心律失常尤其是室性心律失常常會(huì)導(dǎo)致患者的血流動(dòng)力學(xué)改變,是I/R期患者猝死的原因之一。如何減少I/R損傷及預(yù)防再灌注心律失常的發(fā)生是目前研究的熱點(diǎn)。

rhBNP可減輕心肌I/R損傷[12]，但是否對(duì)心肌電生理產(chǎn)生影響，目前研究不多。姚維等[13]研究發(fā)現(xiàn)，健康兔靜脈滴注rhBNP后，心臟三層細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程無明顯變化，認(rèn)為rhBNP對(duì)電生理指標(biāo)沒有直接影響。楊建華[14]研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者應(yīng)用rhBNP可降低溶栓后再灌注心律失常的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，心肌I/R后Na明顯下降，rhBNP預(yù)處理可使下降的Na上調(diào)，逆轉(zhuǎn)電重構(gòu)，這可能是rhBNP降低心律失常發(fā)生率的細(xì)胞學(xué)離子機(jī)制。rhBNP逆轉(zhuǎn)電重構(gòu)的機(jī)制，可能與rhBNP增強(qiáng)抗氧化酶活性，減少氧自由基對(duì)心肌的氧化損傷有關(guān)[12]，rhBNP還可能通過直接擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管及微血管，對(duì)抗神經(jīng)激素應(yīng)激導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈及微血管痙攣，增加冠狀動(dòng)脈及微血管血流量，減輕心肌微血管損傷，從而發(fā)揮保護(hù)I/R損傷心肌的作用。

抗心律失常藥物傳統(tǒng)作用靶點(diǎn)是直接阻斷某一離子通道，但這些藥物對(duì)病變心臟的室性快速心律失常的療效不佳且有負(fù)性效應(yīng)，并可能出現(xiàn)促心律失常的副作用，特別是心律失常抑制試驗(yàn)（cardiac arrhythinia suppression trial，CAST）中，抗心律失常藥物增加死亡率的研究結(jié)果，引發(fā)了我們對(duì)傳統(tǒng)抗心律失常藥物副作用的爭(zhēng)議和擔(dān)憂。心肌細(xì)胞膜上的離子通道本來是有序的，病變心肌多離子通道的改變使動(dòng)作電位時(shí)程改變，導(dǎo)致心律失常。由于動(dòng)作電位的長度與細(xì)胞膜復(fù)極化過程總的離子流相關(guān)，單純阻斷某一離子通道的抗心律失常藥物效果往往不佳，且容易發(fā)生促心律失常的副作用。所以，有效的抗心律失常藥物的新靶點(diǎn)應(yīng)以減輕或逆轉(zhuǎn)離子通道的損傷為楔入點(diǎn)，改變離子通道的環(huán)境尤為重要。

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（編輯: 張青山）

Effects of rhBNP on sodium current in isolated ventricular myocytes from ischemia/reperfusion myocardium of rabbit

DING Chao*, GUE Jie, WANG Dong-Mei, LI Jie, YU Min, PENG Yu-Hong

(Department of Cardiology, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China)

To investigate the effects of recombinant human brain natriuretic peptide (rhBNP) on sodium current (Na) in left ventricular myocytes of rabbit heart undergoing ischemia/reperfusion(I/R), so as to explore the cellular (ionic) basis of rhBNP treatment for antiarrhythmia.Forty-five rabbits were randomly divided into three groups (＝15): ischemic/reperfusion (I/R) group, rhBNP intervention (rhBNP) group and sham-operation control (CON) group. Anesthetized rabbits were subjected to 30min ischemia by ligation of the left anterior descending coronary artery and 120min reperfusion. rhBNP group was injected with rhBNP at a dose of 0.06μg/(kg·min)ear-vein. Single ventricular myocytes were isolated enzymatically from the epicardial zone of the infracted region derived from the hearts in I/R, rhBNP groups and the same anatomy region in CON group. Whole cell patch clamp technique was used to recordNa.The peakNadensity (at –30mV) was significantly decreased in I/R group [(–22.46±5.32)pA/pF,＝12] compared with CON group [(–42.78±5.48)pA/pF,＝16;＜0.01], while it was significantly increased in rhBNP group[(-37.82±5.45)pA/pF,＝15] compared with I/R group(＜0.01).Ischemia/reperfusion induces significant down-regulation ofNa, and pretreatment with rhBNP could attenuate these changes, prevent and reverse this electrical remodeling.

rhBNP; ischemia/reperfusion; patch-clamp; ionic channel

(11276124D).

R972+.6; R541.7

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00156

3013?03?10;

2013?05?15

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題（11276124D）

丁 超, Tel: 0311-87978303, E-mail: dingch2001@163.com