路 瑾, 鮑 立, 盧錫京, 劉艷榮, 賴悅云, 黃曉軍

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Waldenstrom巨球蛋白血癥的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)研究

路 瑾, 鮑 立, 盧錫京, 劉艷榮, 賴悅云, 黃曉軍*

（北京大學(xué)人民醫(yī)院血液病研究所, 北京 100044）

分析Waldenstrom巨球蛋白血癥（WM）形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)（MICM）異常的特點。收集1999至2010年MICM資料完整的初治WM患者41例，男27例、女14例?；仡櫺苑治銎渑R床表現(xiàn)、骨髓形態(tài)、細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫球蛋白重鏈基因重排、黑色素瘤優(yōu)先表達(dá)抗原（PRAME）的表達(dá)及其與臨床預(yù)后之間的關(guān)系。本組中高危患者占58.5%。細(xì)胞免疫表型分析：CD19陽性100.0%，CD20陽性97.6%，CD38陽性74.1%，F(xiàn)MC7陽性36.9%，CD5陽性10.0%，CD23陽性31.6%，HLA-DR陽性83.3%，CXCR4陽性85.7%。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)以及熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)特異性細(xì)胞遺傳學(xué)異常。PRAME在WM中表達(dá)增加，且與骨髓中淋巴細(xì)胞數(shù)相關(guān)，MAGEC1/CT7在WM中不表達(dá)。WM使用含利妥昔單抗聯(lián)合化療較環(huán)磷酰胺+長春地辛+醋酸潑尼松（COP）方案治療未見生存優(yōu)勢。WM具有獨特的MICM特征，通過MICM的綜合檢測有助于早期診斷WM并對疾病進(jìn)行監(jiān)測，利妥昔單抗治療未見明顯優(yōu)勢。

Waldenstrom巨球蛋白血癥; 免疫表型分型; 細(xì)胞遺傳學(xué); 治療

Waldenstrom巨球蛋白血癥（Waldenstrom macroglobulinemia，WM）是一種少見的老年血液惡性腫瘤，國外報告其中位發(fā)病年齡為73歲，發(fā)病率3/1000 000[1]。WM最早于1944年由Waldenstrom描述，是一種漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞淋巴瘤累及骨髓后的診斷，占所有血液惡性腫瘤的2%。由于該病少見，國內(nèi)尚無報道綜合描述其形態(tài)、細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)（morphology，immunophenotype，cytogenetics and molecular，MICM）異常。本文對我所自1999年至2010年資料完整的41例原發(fā)性WM患者的臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)史、MICM以及治療轉(zhuǎn)歸進(jìn)行總結(jié)，以期了解中國WM患者的現(xiàn)狀以及與國外患者的異同。

1 對象與方法

1.1 臨床資料

選取1999年至2010年MICM資料完整的初治WM患者41例。男27例，女14例。診斷時中位年齡65歲，從有癥狀到明確診斷中位時間6個月。伴隨疾病包括丙型肝炎2例，乙型肝炎1例。采用國際預(yù)后積分系統(tǒng)[2]進(jìn)行危險分層，按照年齡＞65歲、血紅蛋白≤115g/L、血小板計數(shù)≤100×109/L、β2微球蛋白＞3mg/L、IgM＞70g/L這5個危險因素分為高、中、低危：年齡65歲以下，只具有其他危險因素1個為低危；年齡65歲以上或是具有其他危險因素2個以上為中危；年齡65歲以上，且有2個或2個以上其他危險因素為高危。其中高危24例（58.5%），中危12例（29.2%），低危5例（12.2%）。診斷以及療效評判采用2013年國際工作組診斷及療效評判標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2 方法

1.2.1 黑色素瘤優(yōu)先表達(dá)抗原及MAGEC1/CT7測定 黑色素瘤優(yōu)先表達(dá)抗原（PRAME）以及MAGEC1/CT7（用ABL作為內(nèi)參）的實時定量檢測采用文獻(xiàn)報告方法[4]。

1.2.2 細(xì)胞免疫表型檢測 主要采用4色抗體組合，主要檢測的抗原有CD20，CD19，CD45，CD103，CD5，CD23，CD11c，CD38，F(xiàn)MC7，Kappa，Lamda，CXCR4以及HLA-DR，由于時間跨度較大，檢測的抗原有所不同。所有單抗購自BD公司，流式細(xì)胞儀為FASCaliber（BD公司）。

1.2.3 G顯帶以及FISH檢測 標(biāo)本來源均為骨髓，接種于含有20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞密度為2×106/ml，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h，按我所常規(guī)的制片和G顯帶技術(shù)進(jìn)行染色體分析。核型分析和異?？寺∶枋霭慈祟惣?xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制[ISCN（2005）]。新制備的染色體玻片在56℃下老化30～60min或室溫下過夜老化。將玻片在37℃ 2×SSC溶液中孵育30min，然后依次置于70%、85%和100%乙醇中各脫水3min。自然干燥玻片。按照FISH操作步驟進(jìn)行FISH實驗。5個GLP探針2μl：（1）RB1缺失探針（13q14）；（2）1q21擴(kuò)增探針（1q21）；（3）IgH雙色分離探針（14q32）；（4）P53缺失探針（17p13）；（5）D13S319缺失探針（13q14）。

1.2.4 一線治療方案 18例患者采用環(huán)磷酰胺+長春堿+醋酸潑尼松及類似方案，5例患者初始治療為苯丁酸氮芥，3例患者初始治療為氟達(dá)拉濱聯(lián)合環(huán)磷酰胺，2例使用沙利度胺作為初始治療，2例患者使用硼替佐米聯(lián)合地塞米松作為初始治療。11例患者使用含利妥昔單抗方案，其中聯(lián)合環(huán)磷酰胺、長春地辛、醋酸潑尼松（R-COP）8例，聯(lián)合環(huán)磷酰胺、醋酸潑尼松（R-CP）1例，聯(lián)合氟達(dá)拉濱、環(huán)磷酰胺（R-FC）1例，單藥利妥昔單抗（美羅華）1例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。不同方案之間生存率的比較采用Log-Rank檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表現(xiàn)、初診時的血常規(guī)及M蛋白檢查

頭暈27例（65.9%），乏力35例（85.4%），神經(jīng)系統(tǒng)癥狀10例（24.4%），各種部位出血11例（26.8%），包括鼻、皮膚、牙齦、眼底以及2例消化道出血。淺表淋巴結(jié)腫12例（29.3%），肝和（或）脾大12例（29.3%）。診斷時白細(xì)胞（2.1～13.0）×109/L，中位4.8×109/L；血紅蛋白45～149g/L，中位78g/L；血小板（21～346）×109/L，中位99×109/L；紅細(xì)胞沉降率57～165mm/h，中位140mm/h；乳酸脫氫酶64～441U/L，中位150U/L；IgM0.68～144.00g/L，中位59.3.0g/L，6例患者為IgM Lamda，35例為IgM Kappa（73.2%）。

2.2 骨髓形態(tài)以及骨髓活檢

骨髓增生3～4級，淋巴細(xì)胞比例23%～99%，中位65.75%，其中15例患者有明顯的漿樣細(xì)胞，3例出現(xiàn)雙核漿細(xì)胞，其余形態(tài)均為成熟淋巴細(xì)胞。16例患者進(jìn)行骨髓活檢，其中3例患者伴有明顯骨髓纖維化，網(wǎng)銀染色（++++），所有16例患者可見小梁間區(qū)或彌漫性大量增生的淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞免疫表型

22例患者檢測的細(xì)胞免疫表型中主要表達(dá)sIg陽性、CD20陽性、CD19陽性以及CD38（表1）；而CD103，CD10，CD25為陰性；部分細(xì)胞表達(dá)FMC7，少數(shù)表達(dá)CD23，CD5，CD138，CD11c陽性1例。在5例檢測了HLA-DR的患者中5例均陽性，4例檢測了CXCR4的患者中3例陽性。

WM: Waldenstrom macroglobulinemia

2.4 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查

35例患者進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，5例出現(xiàn)異常核型，其中6q21缺失2例，inv9有1例，t（2；4）1例，-y出現(xiàn)1例；1例未見分裂相，其余29例均為正常核型。在25例進(jìn)行FISH檢查的患者中（包括1q21擴(kuò)增、13p缺失、17p缺失以及IgH）僅2例出現(xiàn)IgH重組，其余未見異常。

2.5 分子生物學(xué)檢查

8例檢測了IgH重排的患者僅1例陽性，21例檢測PRAME患者中12例≥0.3%，陽性率57.1%，定量值差異較大，范圍0.05%～203.50%（陽性界值0.30%），分析PRAME陽性患者與白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、乳酸脫氫酶、紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白、血IgM數(shù)值、骨髓中淋巴細(xì)胞數(shù)值、β2微球蛋白、流式細(xì)胞儀檢測的表面抗原的表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示PRAME水平與骨髓中淋巴細(xì)胞數(shù)有一定相關(guān)性（＝0.751，＝0.085）。7例患者檢測PCR-MAGEC1/CT7均為陰性。

2.6 治療

在41例患者中，11例采用了含美羅華方案，主要為R-COP，在使用美羅華后，5例患者出現(xiàn)輸注相關(guān)反應(yīng)，表現(xiàn)為寒戰(zhàn)、高熱，地塞米松治療效果不顯著，最長持續(xù)時間6d，1例因呼吸窘迫停止用藥。在10例完成至少2個周期的患者中2例患者出現(xiàn)IgM的反跳，其中1例最高升至98g/L，二線方案使用硼替佐米聯(lián)合環(huán)磷酰胺、地塞米松（BCD）后1個療程達(dá)部分緩解?？稍u估利妥昔單抗的療效的9例患者中，1例完全緩解（R-FC方案），1例微小緩解，7例部分緩解，總有效率100%，完全緩解率11.1%。使用利妥昔單抗方案與COP方案無疾病進(jìn)展生存期及總體生存差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＝0.298，＝0.197；圖1）。

Figure 1 Progression free survival and overall survival for WM with Rituximab containing or not

WM: Waldenstrom macroglobulinemia; R: Rituximab; COP: cyclophosphamide combined with vindisine and prednisone

3 討 論

WM是一種少見的老年血液惡性腫瘤，由于臨床表現(xiàn)的不典型常被漏診，明確其常見的臨床表現(xiàn)以及實驗室檢查特點有助于早期識別。多數(shù)WM呈惰性淋巴瘤的進(jìn)程表現(xiàn)，但有10%～15%的患者可臨床進(jìn)展迅速。在臨床中需及早甄別這些患者。本組41例患者的結(jié)果顯示，82%為IgM Kappa，與國外報告相近，高?；颊哒?8.5%，診斷可能存在不足以及滯后現(xiàn)象，半數(shù)以上患者直至疾病嚴(yán)重階段才能被診斷出來。伴有丙型肝炎僅2例，低于意大利報告的31%的陽性率。

最近在WM研究方面最大的亮點莫過于發(fā)現(xiàn)90%以上的WM患者M(jìn)YD88L265P突變陽性（265位點的亮氨酸突變?yōu)楦彼幔5]，但是目前該項檢查還不能在國內(nèi)開展，現(xiàn)階段仍應(yīng)以流式細(xì)胞免疫表型作為主要診斷手段，故在此我們著重分析WM的免疫表型。在2003年之后國際巨球蛋白血癥工作組就提出新的診斷標(biāo)準(zhǔn)不再強(qiáng)調(diào)IgM的數(shù)值以及骨髓中淋巴細(xì)胞的數(shù)值，而是只要存在單克隆的IgM同時有漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞或是漿細(xì)胞就可以診斷，在使用新的診斷體系后，WM的診斷標(biāo)準(zhǔn)較前更易為臨床接受，但由于未限定IgM的數(shù)值以及骨髓中淋巴細(xì)胞的數(shù)值可能會存在誤診，如在邊緣帶淋巴瘤以及慢性淋巴細(xì)胞白血病/小細(xì)胞淋巴瘤中、濾泡淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤均有報道伴發(fā)IgM的升高，此時凸顯了細(xì)胞免疫表型的診斷價值。我們的結(jié)果顯示W(wǎng)M患者主要表達(dá)CD19，CD20，CD38，HLADR和CXCR4，部分患者表達(dá)CD138，F(xiàn)MC7以及CD23，不表達(dá)CD10和CD25。我們的結(jié)果中100%的患者CD19陽性，97.6%患者CD20陽性，與國外資料報告一致，與Konoplev等[6]的結(jié)果相比，CD23，CD11c以及CD25的比例明顯要低，分別為31.6%61.0%，12.5%81.0%，0.071.0%，但與OWEN等[7]報告的結(jié)果較為接近，可能與各個實驗室使用標(biāo)記的熒光素不同以及患者群不同有關(guān)。盡管不是在所有患者中都檢測了HLA-DR以及CXCR4，但是我們發(fā)現(xiàn)在WM中其陽性率較高，HLA-DR作為白血病的抗原在白血病的診斷中有意義，但其在WM中的意義尚有待于進(jìn)一步研究。CXCR4是與骨髓瘤以及WM細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的黏附有關(guān)的分子，AMD3100可以拮抗其并增加其對硼替佐米的敏感性[4]，未來有可能成為治療的靶點之一。

在WM的形態(tài)學(xué)以及免疫表型上我們都發(fā)現(xiàn)了漿細(xì)胞的出現(xiàn)，甚至在同一患者中出現(xiàn)克隆性的漿細(xì)胞以及克隆性的B細(xì)胞，在形態(tài)上出現(xiàn)既有雙核漿細(xì)胞也有漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞，這一現(xiàn)象在最近一些研究中亦有報道[8]，但其臨床意義尚不完全明了，提示在WM中可能也存在異質(zhì)性。由于WM是少見病，未來多中心的合作研究有望進(jìn)一步分析其臨床意義。

常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢查有40%～50%的患者出現(xiàn)6q的缺失[9]，在我們的35例進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢查的患者中僅5例出現(xiàn)異常核型，在這5例異常核型中6q-占2例。染色體+4被認(rèn)為是WM較為特異的異常，雖然敏感性差，僅見于20%的WM[10]，在我們的結(jié)果中僅1例患者出現(xiàn)涉及4號染色體的異常，即t（2；4）。在我們檢測的25例FISH結(jié)果中顯示未見13q-、17p-，僅2例出現(xiàn)IgH重組信號，說明WM與多發(fā)性骨髓瘤不同，這些經(jīng)常累及骨髓瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)異常在WM中并不多見。

盡管PRAME在WM中的意義尚無相關(guān)研究，但我們發(fā)現(xiàn)在檢測的21例患者中12例陽性，1例為中危患者，其余11例均為高危患者，但分析其與疾病危險分層、IgM數(shù)值均無明顯相關(guān)性；與骨髓中淋巴細(xì)胞數(shù)值有一定相關(guān)性，顯示可能是一個腫瘤負(fù)荷的指標(biāo)，尤其是利妥昔單抗在WM使用后部分患者會出現(xiàn)IgM的反跳現(xiàn)象，PRAME的定量檢測會更準(zhǔn)確地評估是耐藥還是藥物反應(yīng)。由于IgM為一大分子，在體外容易形成多聚體，從而在蛋白電泳上形成一個扁而寬的峰帶，而造成M蛋白檢測的偏差，同時由于偏向于β區(qū)，在M蛋白含量較少的情況下，由于與IgA類似，IgM的M蛋白常常位于β區(qū)，從而會和正常免疫球蛋白混在一起不容易區(qū)分，而會出現(xiàn)M蛋白的假陰性[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在WM中MYD88L265D為特異性突變[5]，可用以鑒別多發(fā)性骨髓瘤和WM，也有人提出在WM中使用PCR方法來定量評估，但目前尚不能實現(xiàn)常規(guī)臨床監(jiān)測。我們的結(jié)果初步顯示在WM中，PRAME可以作為一個很好的預(yù)后以及療效評判標(biāo)準(zhǔn)，無論在IgM＞50g/L還是＜10g/L都與腫瘤負(fù)荷有很好的相關(guān)性，可以作為一個療效評估的指標(biāo)與血清IgM定量以及M蛋白含量進(jìn)行綜合療效判定。而MAGEC1/CT7在WM中均為陰性，可用于鑒別漿細(xì)胞疾病，后者90%以上均為陽性。

在WM的治療中推薦以利妥昔單抗為主的方案，但我們的經(jīng)驗顯示利妥昔單抗在WM患者中副作用較大，在11例使用患者中，高熱常見且持續(xù)時間較長，且目前資料顯示利妥昔單抗較COP方案并未顯示明顯的生存優(yōu)勢以及疾病進(jìn)展方面的優(yōu)勢，但由于本研究的病例數(shù)偏少，有待于進(jìn)一步積累病例后分析。

總之，我們的這41例WM臨床資料顯示，高?；颊哒嫉?8.5%，高于國外報告49%的高危比例，除了常見文獻(xiàn)中報告的抗原表達(dá)之外，我們發(fā)現(xiàn)在WM中HLA-DR以及CXCR4的表達(dá)也較高，可能成為未來治療的靶點之一。同時PRAME在WM中陽性率較高，與骨髓中淋巴細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，可用于實時檢測腫瘤負(fù)荷。

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（編輯: 張青山）

Morphology, immunophenotypes, cytogenetics and molecular biology of Waldenstrom macroglobulinemia

LU Jin, BAO Li, LU Xi-Jing, LIU Yan-Rong, LAI Yue-Yun, HUANG Xiao-Jun*

(Institute of Hematology, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China)

To analyze the morphology, immunophenotypes, cytogenetics and molecular biology (MICM) abnomaities of Waldenstrom macroglobulinemia (WM).Clinical data of 41 patients with newly diagnosed WM from 1999 to 2010 were collected and studied retrospectively (including 27 males and 14 females). Their clinical manifestations, cell morphology in bone marrow, immunophenotypes, and cytogenetics, immunoglobulin heavy chain gene rearrangement, and expression of preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) were examined by G-banding and FISH, PCR-IgH and RQ-PCR-PRAME and MAGE C1/CT7, and the results were analyzed with clinical prognosis.The incidence of high risk patients accounted for 58.5%. Their imunnophenotypes was 100.0% positive to CD19, 97.6% positive to CD20, 74.1% positive to CD38, 36.9% positive to FMC7, 10.0% positive to CD5, 31.6% positive to CD23, 83.3% positive to HLA-DR, and 85.7% positive to CXCR4. There were specific cytogenetic abnormalities found by G-Banding and FISH. RQ-PCR-PRAME had high quantities in WM, which was related to the number of lymphocyte in bone marrow. The MAGE C1/CT7 was negatively expressed in WM. There was no significant survival difference between the Rituximab containing regimen and COP (cyclophosphamide combined with vindisine and prednisone) in treatment of WM.WM has specific MICM characteristics. Integrating those measures is helpful to diagnose WM as early as possible, and to monitor the disease during the treatment. Rituximab has no survival benefit in this cohort of patients.

Waldenstrom macroglobulinemia; immunophenotyping; cytogenetics; therapy

(Z111107067311070).

R553

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00143

2013?07?08;

2013?08?01

北京市科技計劃項目(Z111107067311070)

黃曉軍, Tel: 010-88324577, E-mail: xjhrm@medmail.com.cn