趙 軍, 張傳福, 張廷芬, 晏沐陽*, 宋宏彬*

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CD46在小鼠腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)和意義

趙 軍1, 張傳福2, 張廷芬2, 晏沐陽1*, 宋宏彬2*

（1解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所, 北京 100853;2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所, 北京 100071）

觀察補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46在小鼠腦缺血-再灌注損傷過程中的表達(dá)變化情況，探討其在腦缺血-再灌注損傷中的可能意義。采用線栓法制備小鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，缺血1h后再灌注。記錄腦組織病理的動態(tài)變化，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)法及熒光定量PCR法檢測腦內(nèi)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46的表達(dá)變化。腦組織病理損傷在再灌注后24h達(dá)最重，腦內(nèi)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46的表達(dá)水平逐漸減少，至再灌注后24h達(dá)最低，再灌注96h基本恢復(fù)正常。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46表達(dá)水平與腦組織病理損傷呈負(fù)相關(guān)。腦缺血-再灌注后補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，推測其可能參與腦缺血-再灌注后的免疫損傷過程，通過調(diào)節(jié)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46的激活可為治療腦缺血-再灌注損傷提供參考。

腦缺血; 再灌注損傷; 免疫損傷; 補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46

缺血性腦血管病有著高發(fā)病率、高致殘率和高病死率，嚴(yán)重危害人類健康。腦缺血再灌注損傷，即為大腦短時(shí)間缺血后，突然恢復(fù)血供時(shí)會引起一個(gè)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織繼缺血損傷后再次損傷。研究認(rèn)為，補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活的炎癥效應(yīng)是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要始動因素之一[1]。CD46是補(bǔ)體系統(tǒng)中重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，正常情況下，CD46在補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中抑制補(bǔ)體活化，保護(hù)自身組織免受補(bǔ)體攻擊。但其在腦缺血-再灌注損傷中的表達(dá)和意義并不清楚。我們通過建立小鼠腦缺血再灌注動物模型，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)法和熒光定量PCR技術(shù)，檢測腦組織中不同時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46的表達(dá)變化情況，初步探討其在腦缺血再灌注免疫損傷中的可能意義。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（23±3）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。48只小鼠隨機(jī)分為正常組、缺血再灌注6，24，48，72，96h，每組均為8只。

1.2 腦缺血再灌注動物模型建立

參考Longa等[2]的方法并做適當(dāng)改變，制備小鼠腦缺血再灌注動物模型，用1%的戊巴比妥鈉，按照50mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，在小鼠頸部做正中切口，長度約為1cm，逐步分離小鼠右側(cè)頸總動脈、頸外動脈，并結(jié)扎，在頸總動脈結(jié)扎部位遠(yuǎn)心端剪口，將直徑約為0.125cm的魚線插入，進(jìn)線長度約為1～1.5cm，通過右側(cè)頸內(nèi)動脈到達(dá)右側(cè)大腦中動脈起始處。1h后拔出，實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.3 腦組織損傷病理檢查

取出腦組織多聚甲醛固定，蔗糖脫水后行厚6μm冰凍切片。切片丙酮4℃固定30s，后稍水洗，蘇木素染液染色3min，1%鹽酸酒精分化10s，水洗2s，促藍(lán)液返藍(lán)10s，自來水流水沖洗1min，0.5%伊紅染液染色2min，自來水沖洗，80%酒精，95%酒精，無水乙醇梯度脫水，各1min，二甲苯Ⅰ1min，二甲苯Ⅱ1min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。

1.4 熒光定量RT-PCR檢測CD46mRNA水平

NReasy Mini Kit提取腦組織mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用下列引物擴(kuò)增，CD46：上游5￠-CCCTTCTgTTTCTgCTgTC-3￠，下游5￠-AATATT- TCgCCAgCTCCTgA-3￠；使用GAPDH作為內(nèi)參基因：上游5￠-TgCCCCCATgTTTgTgATg-3￠，下游5￠-TgTggTCATgAgCCCTTCC -3￠。

1.5 免疫熒光檢測腦組織中補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46表達(dá)

按實(shí)驗(yàn)分組的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取腦組織，多聚甲醛固定，蔗糖脫水后行冰凍切片，厚6μm。切片置丙酮中4℃固定10min；用0.01mol/L PBS洗3次，每次5min。封閉：10%正常羊血清溶液，37℃封閉1h，甩去封閉液后加一抗CD46（Santa Cruz Bio- technology），1∶100 （PBS稀釋），37℃孵育1h，PBS洗3次，每次5min；Cy3標(biāo)記的二抗，1∶50（PBS稀釋，避光），37℃孵育1h，PBS洗3次，每次5min；DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照，并用Image-pro plus6.1圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，使用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織損傷區(qū)各時(shí)間點(diǎn)組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色后，光鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)正常組腦神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核較大，細(xì)胞及間質(zhì)無水腫，伴隨再灌注時(shí)間推進(jìn)，損傷區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞核固縮,神經(jīng)細(xì)胞壞死，伴有水腫，至24 h達(dá)最重，72h以后損傷區(qū)組織形態(tài)有所恢復(fù)（圖1）。

2.2 腦缺血再灌注損傷后腦組織中CD46mRNA的表達(dá)變化

與正常組相比，隨著缺血再灌注時(shí)間的延長CD46mRNA的表達(dá)量逐漸減少，24h達(dá)最低（＜0.01），再灌注48h后CD46mRNA表達(dá)量逐漸升高（＜0.01；圖2）。

圖1 各組腦缺血再灌注損傷區(qū)病理觀察

Figure 1 Pathological injury of control groups and ischemia-reperfusion groups(HE×40)

A: 正常組; B: 缺血-再灌注6h組; C: 缺血-再灌注24h組; D: 缺血-再灌注48h組; E: 缺血-再灌注72h組; F: 缺血-再灌注96h組

圖2 腦缺血再灌注后各組CD46 mRNA的表達(dá)變化

Figure 2 CD46 mRNA expression in control groups and ischemia-reperfusion groups

與正常組比較,*＜0.05，＜0.01

2.3 腦缺血再灌注損傷后損傷區(qū)CD46蛋白的表達(dá)變化

正常組損傷區(qū)及周圍可見大量CD46蛋白表達(dá)，從缺血再灌注6h開始，在損傷區(qū)及周圍表達(dá)量逐漸減少，24h達(dá)最低，再灌注48h后逐漸升高，接近正常（圖3）。

圖3 各組腦缺血再灌注損傷區(qū)CD46免疫熒光表達(dá)變化

Figure 3 Expression of CD46 by immuno?uorescent staining in control groups and ischemia-reperfusion (CY3 staining×40)

A: 正常組; B: 缺血-再灌注6h組; C: 缺血-再灌注24h組; D: 缺血-再灌注48h組; E: 缺血-再灌注72h組; F: 缺血-再灌注96h組

3 討 論

盡快恢復(fù)病變血管的血流對缺血性腦血管病雖然有一定幫助，但腦缺血再灌注后會引起腦組織急性炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步加重腦損傷程度。近年來研究[3-5]證明，在腦缺血性再灌注炎癥損傷中補(bǔ)體激活扮演著重要角色，而補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白可以使自身細(xì)胞免遭補(bǔ)體攻擊,其中比較重要的有CD46，又稱膜輔助蛋白，其染色體定位于人類1q32，分子量48256kDa，含有4個(gè)scr同源短序列，為一跨膜蛋白，分布于除紅細(xì)胞外的幾乎所有細(xì)胞。主要功能是作為一種輔助因子，促進(jìn)I因子介導(dǎo)的C3b、C4b降解，從而抑制C3分子激活的聯(lián)級反應(yīng)，被認(rèn)為是補(bǔ)體旁路激活途徑的最有效的抑制因子[6]。有研究證實(shí)[7,8]，在貓ALI和ARDS模型中CD46表達(dá)下調(diào)，可能是炎性損傷加重的原因之一，CD46作為補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在調(diào)節(jié)B細(xì)胞激活中也起到重要作用。但是在腦缺血再灌注損傷中CD46的作用尚不是很清楚，我們通過小鼠腦組織缺血區(qū)病理觀察，來評價(jià)小鼠腦組織損傷程度，用免疫熒光組織化學(xué)法、熒光定量PCR初步觀察了CD46在腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，比較補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46的表達(dá)變化與缺血區(qū)腦組織病理變化的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD46的表達(dá)與腦缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度呈負(fù)向平行關(guān)系。

隨著炎癥反應(yīng)的持續(xù)發(fā)展，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46表達(dá)下調(diào)，機(jī)體自身保護(hù)作用減弱或喪失，以致組織細(xì)胞遭受激活的補(bǔ)體系統(tǒng)攻擊，導(dǎo)致組織損傷，但這種調(diào)節(jié)機(jī)制目前并不是很清楚。此時(shí)，CD46等補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)下調(diào)可能是組織損傷的原因之一，這表明MCAO后補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46在腦缺血再灌注損傷中有抑制損傷的作用，是腦組織缺血再灌注損傷的保護(hù)性因素之一。

下一步可以將CD46作為靶向補(bǔ)體抑制劑進(jìn)行研究。作為另一個(gè)重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59，Song等[9]已經(jīng)在對中國倉鼠卵巢細(xì)胞進(jìn)行的體外補(bǔ)體裂解試驗(yàn)中證明CR2-CD59比沒有靶向性的單獨(dú)CD59分子對保護(hù)細(xì)胞免受補(bǔ)體激活后的細(xì)胞裂解更有效。所以，以后我們也可以嘗試構(gòu)建CR2和CD46的融合分子，證明其在腦缺血再灌注損傷中的作用，為發(fā)展新型腦缺血再灌注治療藥物提供幫助。

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（編輯: 周宇紅）

Expression of CD46 in mouse cerebral ischemia-reperfusion injury and its significance

ZHAO Jun1, ZHANG Chuanfu2, ZHANG Tingfen2, YAN Muyang1*, SONG Hongbin2*

(1Institute of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Institute of Disease Control and Prevention, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)

To investigate the dynamic changes of complement regulatory protein CD46 expression and discuss its possible mechanisms cerebral ischemia-reperfusion injury.The middle cerebral artery occlusion (MACO) model was induced through filament method. Brain pathological injury was recorded. Immuno?uorescence and real time RT-PCR method were used to detect complement regulatory protein CD46 expression.Brain pathological injury was the most serious at 24h after reperfusion. The complement regulatory protein CD46 expression decreased gradually after local cerebral ischemia-reperfusion injury, to the lowest at 24h after reperfusion, and returned to normal at 96h after reperfusion. complement regulatory protein CD46 expression was negatively correlated with brain pathological injury.The complement regulatory protein CD46 has a significant change after cerebral ischemia-reperfusion. It is speculated that it participates in the injury after ischemia-reperfusion. So regulation of complement regulatory protein CD46 is likely to be a new important method of treatment for ischemia-reperfusion injury.

cerebral ischemia; reperfusion injury; immune injury; complement regulatory protein CD46

( No. 81070969)

R743

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00036

2012-09-26;

2012-11-13

國家自然科學(xué)基金（No. 81070969）

晏沐陽, Tel: 010-55499138, E-mail: yanmy301@sina.com; 宋宏彬, Tel: 010-66948475, E-mail: hongbinsong@263.net