劉如秀, 劉 宇, 汪艷麗, 李 泱, 彭 杰, 劉金鳳

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模擬缺血再灌注對乳兔竇房結(jié)細胞起搏電流的影響

劉如秀1*, 劉 宇1, 汪艷麗1, 李 泱2, 彭 杰1, 劉金鳳1

（1中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科, 北京 100053;2解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所, 北京 100853）

觀察模擬缺血再灌注（I/R）對乳兔竇房結(jié)細胞形態(tài)及起搏電流（f）的影響，闡明I/R制備竇房結(jié)細胞損傷的電生理特征改變。選用新生新西蘭乳兔，采用雙酶解法/差速貼壁法分離竇房結(jié)細胞，模擬I/R制備受損模型，利用膜片鉗技術(shù)記錄動作電位和f。乳兔竇房結(jié)細胞主要呈梭形，搏動頻率快，細胞表面光滑完整。模擬I/R后大部分細胞腫脹變形，偽足回縮，胞膜有較多顆粒、欠光滑。模擬再灌注后竇房結(jié)細胞f最大舒張電位由（-50.9±5.3）mV變?yōu)椋?43.5±4.6）mV，電流密度由（-3.2±0.41）pA/pF變?yōu)椋?2.47±0.32）pA/pF，其穩(wěn)態(tài)激活曲線較對照組明顯右移，半數(shù)激活電壓由（-98.6±2.3）mV變?yōu)椋?107.8±4.7）mV（＜0.05）。模擬I/R導(dǎo)致竇房結(jié)細胞損傷，細胞電生理發(fā)生改變，尤以f重構(gòu)為主。

竇房結(jié); 再灌注損傷; 膜片鉗術(shù); 起搏電流

病態(tài)竇房結(jié)綜合征（病竇綜合征，sick sinus syndrome，SSS）是臨床常見危重疾病，發(fā)病率、猝死率較高，有關(guān)其發(fā)病機制及防治措施的研究一直是心血管病研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一[1]。缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后導(dǎo)致心律失常已有較多研究，但其誘發(fā)SSS的機制尚不明確[2]。超極化激活電流（funny current，f），又稱起搏電流，其作為心電活動的起始電流，不僅是心臟起搏的主要離子流，在SSS中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，而且與再灌注所致的心律失常關(guān)系密切[3,4]。本研究采用膜片鉗技術(shù)比較I/R前后乳兔竇房結(jié)細胞（sinoatrial node cells，SNCs）起搏電流的差異，研究I/R對SNCs電生理的影響，初步探討I/R引起SSS的細胞電生理學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

出生24h內(nèi)新西蘭大耳白兔，雌雄不拘，由廣安門醫(yī)院動物實驗中心提供。DMEM（美國Invitrogen公司），胎牛血清、胰酶（Gibco公司），Ⅱ膠原酶型、Triton-100和EDTA-Na2（Sigma公司）。模擬缺血溶液（mmol/L）：NaCl 98.5、KCl 10.0、NaH2PO40.9、NaHCO36.0、CaCl21.8、MgSO41.2、乳酸鈉40.0、HEPES 20.0，用1%的稀鹽酸調(diào)pH至6.8；模擬再灌注溶液（mmol/L）：NaCl 129.5、KCl 5.0、NaH2PO40.9、NaHCO320.0、CaCl21.8、MgSO41.2、葡萄糖55.0、HEPES 20.0，用1mmol/L的NaOH調(diào)pH至7.4。起搏離子流灌流液（mmol/L）：NaCl 137.0、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl20.5、NaHCO323.8、NaH2PO40.4、葡萄糖10.0，以KOH調(diào)pH至7.4。起搏離子流電極內(nèi)液（mmol/L）：NaCl 6.0、MgCl21.0、HEPES 5.0、KCl 140.0，以KOH調(diào)pH至7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳兔SNCs的分離、純化、培養(yǎng) 選擇出生24h內(nèi)的新西蘭乳兔75只，每次5只共重復(fù)15次，于75%的乙醇中浸泡5～10s，后仰臥位固定置于超凈臺中，眼科直剪剪開胸前壁，暴露心臟，在解剖顯微鏡下于界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部取2mm×2mm×2mm的組織塊于DMEM中，吹打后用眼科彎鑷將組織塊夾入PBS液中沖洗，后置于PBS液中用眼科彎剪剪成0.3mm×0.3mm×0.3mm的小塊，吸棄上清。然后加入0.08%的胰酶8ml于37℃水浴中振蕩5min，吹打沉淀后吸棄上清液。再次加入0.025%Ⅱ型膠原酶8ml于37℃水浴中振蕩10min，再吹打1min，沉淀后吸取上清液于50ml離心管中，離心管中含20ml 15%FBS的DMEM；第三次消化步驟、時間均同前，第四次消化步驟同前，時間改為8min。用400目金屬濾網(wǎng)過濾后平均移入離心管中，940r/min離心7min。離心后倒掉上清，加入培養(yǎng)液，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/L，將單細胞懸液接種于6個小的培養(yǎng)皿中，錐蟲藍（臺盼藍）檢測活細胞率達95%以上。將培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育90min，差速貼壁以除去成纖維細胞，后加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）使其終濃度為0.1mmol/L并繼續(xù)培養(yǎng)。24h后細胞換液，此后隔天換液，每次換液均加入0.1mmol/L 5-BrdU。

1.2.2 模擬I/R模型的建立 參考Xiang等[5]的制備方法，以缺氧缺糖模擬缺血，以恢復(fù)氧和糖供應(yīng)模擬再灌注。模擬缺血：將培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液吸棄，加入2ml預(yù)先用95%N2＋5%CO2飽和的模擬缺血溶液，反復(fù)沖洗3次，加2ml的缺血液后置于自制密閉盒中持續(xù)通以30倍體積約10L的95%N2＋5%CO2混合氣，充分排盡密閉盒中殘余的氧氣后，用止血鉗鉗閉進出管道，以缺氧缺糖模擬缺血放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h。模擬再灌注：從培養(yǎng)箱內(nèi)取出自制密閉盒，將培養(yǎng)皿中的缺血液吸棄，加入2ml含10%胎牛血清的模擬再灌注液，反復(fù)沖洗3次，再向培養(yǎng)皿內(nèi)加入2ml模擬再灌注液以恢復(fù)氧和糖的供應(yīng)，放回5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3h。模擬再灌注結(jié)束后，即取SNCs行膜片鉗實驗。

將培養(yǎng)的SNCs分為兩組：正常組，細胞于37℃孵育，以模擬再灌注溶液替換培養(yǎng)液，并向其中持續(xù)通以95%O2＋5%CO2混合氣；模擬I/R組，處理方法同上。兩組均預(yù)先用含15%空白血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30min。

1.2.3 培養(yǎng)SNCs的形態(tài)學(xué)鑒定 在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)SNCs的形態(tài)、大小、搏動頻率。

1.2.4 SNCs起搏離子流的記錄 將各組細胞玻片移入恒溫灌流槽內(nèi)，通入低流量95%O2＋5%CO2混合氣的灌流液持續(xù)灌流，操縱電極與細胞形成巨阻抗封接（＞1.0GΩ），負壓抽吸配合脈沖電壓打破封接的膜片，在電流鉗模式下記錄到SNCs的最大舒張期電位后，再換為電壓鉗模式記錄f。脈沖發(fā)放由計算機通過PClamp軟件包（Axon）控制，數(shù)字信號經(jīng)Digidata 1200數(shù)模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)成電信號，由Axon-200B放大器放大，經(jīng)電極絲和微電極導(dǎo)入細胞，產(chǎn)生的電信號由模數(shù)轉(zhuǎn)換器變成數(shù)字信號，經(jīng)PClamp程序采集并儲存于電腦硬盤中。微電極尖端阻抗為4～6MΩ，濾波頻率2kHz。實驗溫度控制在35℃，灌流速度為2ml/min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SNCs的形態(tài)學(xué)

倒置顯微鏡觀察，SNCs呈梭形，胞核中等大小，呈橢圓形，位于胞體中間，細胞表面光滑完整，狀態(tài)較好。模擬I/R后大部分細胞都已經(jīng)凋亡，存活的SNCs雖仍然貼壁，但已出現(xiàn)腫脹變形，偽足回縮，甚至細胞脫落，細胞表面有較多顆粒，表面不夠光滑（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

Figure 1 Morphology of the cells under inverted microscope(×200) A: normal sinoatrial node cells; B: ischemia/reperfusion sinoatrial node cells

2.2 乳兔SNCs的動作電位時程

用電流鉗技術(shù)通過全細胞記錄模式，檢測搏動頻率較快的SNCs的動作電位，其動作電位有舒張期自動除極化（圖2）。先后記錄了15個梭形細胞的動作電位，其最大舒張電位為（-50.9±5.3）mV，I/R組為（-43.5±4.6）mV，動作電位幅度為（81.9±4.8）mV，I/R組為（78.8±5.8）mV。

圖2 SNCs的動作電位

Figure 2 Action potential of SNCs SNCs: sinoatrial node cells; I/R: ischemia/reperfusion

2.3 起搏離子流的記錄

將膜電位鉗制在-50mV，超極化至-180mV，鉗制時間為2 000ms，各指令電壓末端除極化至0mV。在超極化鉗制時可見逐漸激活和增大的內(nèi)向離子流，除極化時記錄到大小不等的尾電流，當向灌流液中加入2mmol/L的銫離子（Cs+）時，內(nèi)向離子流及其尾電流在各測試電位基本消失，表明該內(nèi)向電流即為f（圖3）。

2.4 模擬缺血預(yù)適應(yīng)對SNCs If及電壓曲線（I-V）的影響

將膜電位鉗制在-40mV，以-10mV步階超極化至-140mV，鉗制時間為2 000ms，各指令電壓末端除極化至0mV。在-120mV時，乳兔SNCsf的電流密度為（-3.2±0.41）pA/pF，I/R后電流密度變?yōu)椋?2.47±0.32）pA/pF（＜0.01；圖4）。f的幅值具有電壓依賴性特征，隨著電位向超極化方向移動，正常SNCs電流迅速增加，I/R后電流雖然也有增加，但增加的幅度較正常SNCs顯著減小，二者具有顯著差異（＜0.05；圖5）。

2.5 模擬缺血預(yù)適應(yīng)對SNCs If激活曲線的影響

經(jīng)過3h的模擬再灌注，正常SNCs的半激活電壓（Vl/2）由（-98.6±2.3）mV變?yōu)椋?107.8±4.7）mV（＜0.05），提示V1/2移向更負，將不利于通道的激活，而激活曲線斜率雖有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05；圖6）。

圖3 SNCs的起搏電流

Figure 3 Funny current ofSNCs SNCs: sinoatrial node cells

圖4 I/R對起搏電流的影響

Figure 4 Effect of I/R on funny current SNCs: sinoatrial node cells; I/R: ischemia/reperfusion

圖5 I/R對起搏電流I-V曲線的影響

Figure 5 Effect of I/R on I-V curve of funny current SNCs: sinoatrial node cells; I/R: ischemia/reperfusion

圖6 I/R后SNCs If穩(wěn)態(tài)激活曲線變化

Figure 6 Change in steady-state activation curve of SNCs after I/R SNCs: sinoatrial node cells; I/R: ischemia/reperfusion

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，模擬I/R使SNCs起搏電流密度顯著減低。進一步的離子流電壓依賴性研究顯示，在各測試電壓下，I/R使通道電流均減少，超極化電壓越負，此效應(yīng)越強。進一步從通道的穩(wěn)態(tài)激活研究看出，I/R使通道穩(wěn)態(tài)激活曲線右移，影響通道的開放。研究結(jié)果提示，模擬I/R可改變SNCs的電生理特性，減慢起搏電流的激活，影響竇房結(jié)的起搏傳導(dǎo)功能。I-V曲線上移，激活曲線左移，半數(shù)最大激活電壓向超極化方向移動，且可顯著降低各指令電壓下的f密度，延長動作電位時程及復(fù)極化時間，導(dǎo)致SNCs起搏電流密度降低，從而降低SNCs的自發(fā)性最終產(chǎn)生SSS。

f在調(diào)解自主心律和心率方面具有重要作用。筆者前期的研究表明，模擬I/R可引起在體及離體SNCs結(jié)構(gòu)和功能的改變，影響其電信號發(fā)放的節(jié)律和頻率，導(dǎo)致電生理活動的紊亂[6]。I/R可降低乳鼠SNCs瞬時外向鉀電流和超速激活延遲整流鉀電流通道激活、加快乳鼠SNCs通道失活，同時可降低SNCs的4期自動去極化速度，延長動作電位時程及復(fù)極化時間，降低SNCs的自律性。超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN）4作為HCN基因家族的亞型，被認為是心臟起搏細胞產(chǎn)生自動節(jié)律的基礎(chǔ)，其參與編碼的超極化激活電流是心臟起搏調(diào)控的重要部分[7,8]。f離子流幅值越大，則動作電位4相舒張除極化坡度越陡，f離子流激活速度越快，SNCs的自律性越高[9,10]。Ozcan等[11]研究表明觸發(fā)或自律性異常是再灌注心律失常的發(fā)生機制，鈣離子超負荷發(fā)揮作用。鐘理等[12]研究表明模擬I/R溶液可引起離子濃度的變化與酸堿平衡的紊亂。有研究表明，缺血可導(dǎo)致抑制f電流，腺苷導(dǎo)致f幅值降低[13]。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，胰酶結(jié)合Ⅱ型膠原酶逐步消化乳兔竇房結(jié)可得到活性高、表面光滑、適合膜片鉗實驗的細胞，其效果明顯優(yōu)于單胰酶消化法。本實驗采用的模擬I/R造模方法參照了Koyama等[14]誘導(dǎo)心肌細胞死亡的模型，考慮到組織缺血時由于糖酵解引起的酸堿平衡紊亂、離子濃度改變等因素對細胞損傷的發(fā)生都有重要影響，實驗采用了模擬I/R溶液來反映I/R時離子濃度的變化與酸堿紊亂，并用95%N2＋5%CO2混合氣取代空氣來模擬低氧環(huán)境。

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（編輯: 張青山）

Effect of simulated ischemia-reperfusion on funny current in newborn rabbit sinoatrial node cells

LIU Ru-Xiu1*, LIU Yu1, WANG Yan-Li1, LI Yang2, PENG Jie1, LIU Jin-Feng1

(1Department of Cardiology, Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 10053, China;2Institute of Geriatric Cardiovascular Diseases, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

To determine the effect of simulated ischemia/reperfusion (I/R) on the morphology and funny current(f) in sinoatrial node cells(SNCs) of newborn rabbits, and clarify the electrophysiological characteristic changes of SNCs after ischemia-reperfusion injury.SNCs were isolated from newborn New Zealand rabbits by double enzyme hydrolysis/differential anchoring velocity, and then cultured under simulated ischemia reperfusion damage(95%N2＋5%CO2for 1h followed by 95%O2＋5%CO2for 3h). The cells cultured under normal condition(95%O2＋5%CO2) served as normal control. The morphological changes of the cells were observed under inverted microscope. Patch-clamp technique was used to record action potential and thef.Normal SNCs were mainly spindle in shape and smooth and complete in surface, with fast frequency of pulsation. While, the SNCs after simulated I/R injury showed swelling and distortion, with granular and unsmooth cell membrane and retraction of pseudopodia. After simulated reperfusion, the maximum diastolic potential offin SNCs was changed from (-50.9±5.3)mV to (-43.5±4.6)mV, current density was changed from (-3.2±0.41)pA/pF to (-2.47±0.32)pA/pF, with its steady-state activation curve obvious to the right when compared with that of control, and the half activating voltage was changed from (-98.6±2.3)mV to (-107.8±4.7)mV (＜0.05).Simulated I/R induces injury in SNCs. Cell electrophysiological characteristics are changed, mainly in thefreconstruction.

sinoatrial node; reperfusion injury; patch-clamp technique; funny current

(81173447).

R364.1

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00215

2013?05?08;

2013?06?17

國家自然科學(xué)基金（81173447）

劉如秀, E-mail: liuruxiu1@163.com