王榮江 石麒麟 趙紅星 邵四海 鄭銀元 陳煜

術(shù)前動(dòng)脈化療栓塞對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡、血管生成的影響

王榮江 石麒麟 趙紅星 邵四海 鄭銀元 陳煜

目的 探討術(shù)前動(dòng)脈化療栓塞對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡及腫瘤血管生成相互關(guān)系的影響及臨床意義。 方法 分別選取術(shù)前行動(dòng)脈化療栓塞及同期單純手術(shù)治療的膀胱癌患者50例（觀察組）、30例（對(duì)照組），采用EliVision二步法檢測(cè)Ki-67的表達(dá)情況，細(xì)胞凋亡檢測(cè)應(yīng)用DNA末端標(biāo)記法（Tunel法），計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）、增殖指數(shù)（LI）和微血管密度計(jì)數(shù)（MVD）。比較兩組患者的3年生存率和復(fù)發(fā)率。分析觀察組患者化療栓塞前后AI、LI、MVD的變化及其與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 兩組患者3年生存率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），觀察組3年復(fù)發(fā)率顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。觀察組患者栓塞后MVD及LI顯著下降、AI顯著升高（均P＜0.01），其中高分級(jí)、浸潤(rùn)性及初發(fā)患者栓塞后MVD及LI明顯下降、AI顯著升高，復(fù)發(fā)患者僅MVD明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。AI與LI、MVD呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），LI與MVD呈正相關(guān)（P＜0.01）。觀察組中復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)者栓塞前后MVD的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），未復(fù)發(fā)者栓塞后LI顯著下降、AI顯著升高（P＜0.01）；生存者栓塞后MVD、LI明顯下降、AI顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。 結(jié)論 細(xì)胞的增殖和凋亡狀況、微血管密度可作為膀胱癌的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。術(shù)前動(dòng)脈化療栓塞可以明顯降低膀胱癌組織的LI和MVD，增高AI，調(diào)節(jié)膀胱癌的分化程度，降低復(fù)發(fā)率。

化療栓塞 膀胱癌 凋亡指數(shù) 增殖指數(shù) 微血管密度

膀胱癌生物學(xué)行為復(fù)雜多變，突出表現(xiàn)為易復(fù)發(fā)、多發(fā)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。已有的研究表明，細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡障礙是膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因。腫瘤發(fā)展過(guò)程中血管生成可以影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖狀態(tài)。本研究通過(guò)觀察術(shù)前動(dòng)脈化療栓塞的膀胱癌患者膀胱癌組織中增殖指數(shù)（LI）、凋亡指數(shù)（AI）和微血管密度（MVD）的表達(dá)，旨在探討動(dòng)脈化療栓塞對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡及腫瘤血管生成的影響及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2004-01—2010-06我院收治的膀胱癌患者50例（觀察組），男35例，女15例，年齡38～78（60.98±9.05）歲；術(shù)前均行動(dòng)脈栓塞化療。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟腫瘤浸潤(rùn)深度分期：非浸潤(rùn)性癌16例，浸潤(rùn)性癌34例。根據(jù)WHO 2004年膀胱尿路上皮癌惡性程度病理分級(jí)：低分級(jí)尿路上皮癌13例，高分級(jí)尿路上皮癌37例。淋巴轉(zhuǎn)移5例，盆壁浸潤(rùn)3例，腹腔轉(zhuǎn)移2例，肺轉(zhuǎn)移2例；單發(fā)29例，多發(fā)21例，因復(fù)發(fā)入院者14例。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)單純尿路上皮細(xì)胞癌44例，尿路上皮細(xì)胞癌合并腺癌3例，合并鱗癌3例。同期另?yè)駟渭兪中g(shù)治療的膀胱癌患者30例作為對(duì)照組，男20例，女10例，年齡29～80（59.62±10.13）歲。非浸潤(rùn)性癌8例，浸潤(rùn)性癌22例。低分級(jí)尿路上皮癌7例，高分級(jí)尿路上皮癌23例。淋巴轉(zhuǎn)移2例，盆壁浸潤(rùn)1例，腹腔轉(zhuǎn)移0例，肺轉(zhuǎn)移2例；單發(fā)16例，多發(fā)14例，因復(fù)發(fā)入院者7例。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)單純尿路上皮細(xì)胞癌27例，尿路上皮細(xì)胞癌合并腺癌2例，合并鱗癌1例。兩組患者性別、年齡、浸潤(rùn)深度、病理分級(jí)及轉(zhuǎn)移、合并等情況的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)脈化療栓塞 采用Seldinger技術(shù)，局麻下經(jīng)皮穿刺，用5～6Fcobra導(dǎo)管選擇一側(cè)股動(dòng)脈進(jìn)路至髂內(nèi)動(dòng)脈，先行盆腔動(dòng)脈造影明確腫瘤部位及膀胱動(dòng)脈供血情況，再分別超選擇性至膀胱動(dòng)脈至腫瘤區(qū)域主要供血?jiǎng)用}分支，了解腫瘤血管的形態(tài)和走向，結(jié)合術(shù)前膀胱鏡示腫瘤位置，放置導(dǎo)管位置一般超選至膀胱動(dòng)脈口，給予絲裂霉素20mg或羥喜樹(shù)堿10mg聯(lián)合順鉑60mg藥物灌注+明膠海綿顆粒栓塞治療1次?；熕ㄈ?d行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切或膀胱部分切除術(shù)。

1.2.2 標(biāo)本制備及檢測(cè) 觀察組患者化療栓塞前膀胱鏡檢查所取腫瘤標(biāo)本及化療栓塞后手術(shù)標(biāo)本，常規(guī)經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。Ki-67檢測(cè)：選取代表性蠟塊連續(xù)4μm切片，采用EliVision二步法行免疫組化染色，使用鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；EliVision試劑盒及相應(yīng)抗體均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞凋亡檢測(cè)應(yīng)用DNA末端標(biāo)記法（Tunel法）。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) LI判定標(biāo)準(zhǔn)：以腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞核有棕色顆粒著色為陽(yáng)性標(biāo)記,計(jì)數(shù)隨意5個(gè)400倍視野的癌巢區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，LI=（Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)）×100%。MVD判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤組織及其鄰近間質(zhì)內(nèi)，胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇即被認(rèn)為是單個(gè)微血管。MVD參照Weidner等[1]報(bào)道的方法，先在40倍光學(xué)顯微鏡下掃描，選取腫瘤組織內(nèi)微血管高度密集區(qū)，即“熱點(diǎn)”，然后在400倍視野下計(jì)數(shù)腫瘤內(nèi)的微血管的數(shù)目，記錄3個(gè)視野中的微血管數(shù)目并取其平均數(shù)。AI判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野并計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞，記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，其中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比即為AI，AI=（凋亡細(xì)胞數(shù)/1000）× 100%。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察化療栓塞前后腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡、MVD表達(dá)情況及術(shù)后患者生存率和復(fù)發(fā)率，分析免疫組化結(jié)果與病理分級(jí)、分期及預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，栓塞化療前后的比較采用t檢驗(yàn)，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者3年生存率及復(fù)發(fā)率的比較 對(duì)照組3年生存率為83.3%（25/30），觀察組為88.0%（44/50），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組1、2、3年復(fù)發(fā)率分別為10.0%（3/30）、13.3%（4/30）、30%（9/30），觀察組分別為8.0%（4/50）、4.0%（2/50）、6.0%（3/50），觀察組3年復(fù)發(fā)率顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

2.2 觀察組患者化療栓塞前后膀胱癌組織的比較 見(jiàn)圖1～6。

圖 1 栓塞前AI較低（Tunel法，×400）

圖2 栓塞前Ki-67表達(dá)較強(qiáng)（EliVision二步法，×400）

圖3 栓塞前MVD較高（EliV-ision二步法，×400）

圖 4 栓塞后 AI升高（Tunel法，×400）

圖5 栓塞后Ki-67表達(dá)減弱（EliVision二步法，×400）

由圖1～6可見(jiàn)，化療栓塞后MVD、Ki-67表達(dá)強(qiáng)度下降，AI明顯升高。

圖6 栓塞后MVD降低（EliVision二步法，×400）

2.3 觀察組患者化療栓塞前后膀胱癌組織MVD、AI、LI值的比較 見(jiàn)表1。

表1 觀察組患者化療栓塞前后膀胱癌組織MVD、AI、LI值的比較

由表1可見(jiàn)，觀察組患者栓塞后MVD及LI值顯著下降、AI顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。其中高分級(jí)、浸潤(rùn)性及初發(fā)患者栓塞后MVD及LI值明顯下降、AI顯著升高，復(fù)發(fā)患者僅MVD值明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。Pearson相關(guān)性分析顯示，AI與LI、MVD呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），LI與MVD呈正相關(guān)（P＜0.01）。

2.4 MVD、AI、LI值與栓塞后腫瘤復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系

觀察組患者隨訪6～78個(gè)月，平均19.8個(gè)月。動(dòng)脈化療栓塞前后MVD、AI、LI表達(dá)與患者預(yù)后和生存的關(guān)系見(jiàn)表2～3。

表2 MVD、AI、LI值與患者預(yù)后的關(guān)系

表3 MVD、AI、LI值與患者生存的關(guān)系

由表2～3可見(jiàn)，復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)者栓塞前后MVD值 的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），復(fù)發(fā)者栓塞前后AI、LI值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而未復(fù)發(fā)者栓塞后LI值顯著下降、AI值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；死亡者栓塞前后3項(xiàng)指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），生存者栓塞后MVD、LI值明顯下降、AI值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

3 討論

細(xì)胞增殖和凋亡狀況是預(yù)測(cè)膀胱癌發(fā)展及預(yù)后的重要指標(biāo)，研究腫瘤增殖和細(xì)胞凋亡是了解腫瘤和控制腫瘤的一條途徑。細(xì)胞增殖失調(diào)和細(xì)胞凋亡障礙是膀胱癌惡性增生發(fā)生、發(fā)展的重要原因[1-2]。

1971 年，F(xiàn)olkman等[3]提出了“腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移依賴(lài)于腫瘤血管的形成”的概念。腫瘤的新生血管化程度與腫瘤惡性程度、侵襲性及其預(yù)后密切相關(guān)[4]。MVD是反映腫瘤微血管形成程度的標(biāo)志，不僅可定量反映出膀胱腫瘤的血管生長(zhǎng)情況，而且一定程度上可作為預(yù)測(cè)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)。腫瘤發(fā)展過(guò)程中微環(huán)境的改變可以影響到腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖狀態(tài)[5]，而血管生成正是微環(huán)境改變的重要表現(xiàn)形式之一。

膀胱癌細(xì)胞凋亡與腫瘤分級(jí)和分期呈負(fù)相關(guān)，AI是衡量組織中細(xì)胞凋亡發(fā)生程度的一項(xiàng)指標(biāo)。細(xì)胞凋亡多者，說(shuō)明腫瘤在各種因素的作用下，其生長(zhǎng)繁殖受到限制，腫瘤的惡性程度低，因此預(yù)后較好。相反，細(xì)胞凋亡少則說(shuō)明腫瘤受限制的程度差，腫瘤惡性程度高，患者預(yù)后較差[6]。腫瘤LI的檢測(cè)對(duì)于判斷腫瘤的惡性程度、評(píng)估預(yù)后及選擇適當(dāng)?shù)闹委煷胧┮饬x重大。Ki-67是與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，為細(xì)胞增殖的一種標(biāo)記，其表達(dá)水平不僅能客觀反映膀胱癌的增殖活性，并能估計(jì)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移潛能，Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤惡性程度正相關(guān)，表達(dá)越高，腫瘤增生活躍，復(fù)發(fā)的可能性越高。因此檢測(cè)Ki-67在腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)度，可以評(píng)估腫瘤細(xì)胞的生物活性并提供腫瘤演變的信息[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱腫瘤中微血管的形成與腫瘤細(xì)胞的增殖活性及其AI明顯相關(guān)，AI與LI、MVD呈負(fù)相關(guān)，LI與MVD呈正相關(guān)。本組表淺性腫瘤的AI顯著高于浸潤(rùn)性腫瘤，而浸潤(rùn)性腫瘤的MVD顯著高于表淺性腫瘤，表淺腫瘤處于血管形成前期時(shí)以細(xì)胞凋亡為主，以抵消細(xì)胞的過(guò)度增生，使病變保持相對(duì)的靜止?fàn)顟B(tài)。一旦進(jìn)入血管期，新生血管形成，血管內(nèi)皮細(xì)胞及宿主的良性細(xì)胞產(chǎn)生的各種生長(zhǎng)因子通過(guò)新生血管源源不斷運(yùn)至腫瘤細(xì)胞，同時(shí)改善了腫瘤細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，致使細(xì)胞凋亡減少、細(xì)胞增殖，這也是膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的原因之一[9]。

膀胱癌術(shù)前超選擇性腫瘤動(dòng)脈化療栓塞，切斷了腫瘤的血供，造成癌細(xì)胞缺血缺氧，減低腫瘤細(xì)胞活力，加快其壞死[10]，顯著提高腫瘤局部及盆腔區(qū)域的初始抗癌藥物濃度；化療藥物發(fā)揮細(xì)胞毒作用都與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抵制細(xì)胞增殖有關(guān)。同時(shí)，抑制腫瘤新生血管生成及增殖細(xì)胞核抗原下降，誘導(dǎo)促凋亡基因表達(dá)，使膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，增殖抑制；有遏制癌細(xì)胞進(jìn)一步分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移作用[11-12]。本研究結(jié)果顯示，動(dòng)脈化療栓塞后腫瘤縮小，表面均有組織的不同程度壞死，術(shù)野清晰，術(shù)中基本無(wú)出血，3年復(fù)發(fā)率明顯降低。

化療栓塞后MVD、LI明顯下降，AI升高，前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；熕ㄈ驧VD、LI隨著腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期的升高而降低，AI隨著病理分級(jí)的增高而增高，化療栓塞前后低分級(jí)和非浸潤(rùn)性膀胱癌組織中陽(yáng)性表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而高分級(jí)和浸潤(rùn)性膀胱癌組織中陽(yáng)性表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AI、LI在初發(fā)膀胱癌者栓塞前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在復(fù)發(fā)膀胱癌中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MVD在初發(fā)和復(fù)發(fā)膀胱癌栓塞前后下降均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)論均說(shuō)明動(dòng)脈化療栓塞后腫瘤組織內(nèi)的血管減少，腫瘤生長(zhǎng)受限，甚至因缺血而使腫瘤壞死，還可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖達(dá)到腫瘤消失或縮小的目的。MVD、AI、LI與栓塞后腫瘤復(fù)發(fā)率和患者生存率有明顯的相關(guān)性，MVD、LI與病死率和復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，AI則呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，術(shù)前動(dòng)脈化療的抗腫瘤效應(yīng)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖密切相關(guān)，可以明顯地降低高分級(jí)和浸潤(rùn)性膀胱癌組織的LI和MVD值，增高細(xì)胞凋亡率，但對(duì)低分級(jí)和非浸潤(rùn)性無(wú)明顯影響，這能否作為術(shù)前動(dòng)脈化療適應(yīng)證之一尚有待進(jìn)一步證實(shí)，但對(duì)于選擇適合術(shù)前動(dòng)脈化療患者具有一定指導(dǎo)意義，同時(shí)術(shù)前動(dòng)脈化療具有降低術(shù)后復(fù)發(fā)率的優(yōu)點(diǎn)。

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Cell proliferation,apoptosis and neovascularization of bladder cancer after arterial chemoembolization

Chemoembolization Bladder cancer Apoptosis index Proliferation index Microvessel density

2012-05-07）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

313000 湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院、湖州市第一人民醫(yī)院泌尿外科（王榮江、邵四海、陳煜），病理科（石麒麟），放射介入科（趙紅星、鄭銀元）

【 Abstract】Objective To investigate the cell proliferation,apoptosis and tumor angiogenesis of bladder cancer after transcatherter arterial chemoembolization(TACE). Methods The apoptosis index(AI)，proliferation index(LI)and microvessel density(MVD)of cancer tissue were examined by immunohistochemistry in 50 bladder cancer patients before and after chemoembolization (TACE group)and in 30 patients with surgical treatment(control group).The 3-y survival rates and recurrence rates were compared between two groups.The correlation of cancer cell proliferation,apoptosis and MVD before and after chemoembolization with postoperative survival and the recurrence was analyzed. Results There was no significant difference in 3-y survival rate between two groups(P＞0.05).The 3-year recurrence rate in TACE group was significantly lower than that in control group(P＜0.01).AI was increased significantly after chemoembolization,while MVD and LI were decreased significantly(P＜0.01), especially for the high grade,invasive or incipient patients.But the relapsing patients had only decline of MVD.AI was negatively correlated with MVD and LI(P＜0.01),while LI was positively correlated with MVD(P＜0.01).There was significant difference in MVD of cancer tissue between relapsed group and non-relapsed group both before and after chemoembolization.LI declined significantly,while AI increased significantly in non-relapsed group after chemoembolization(P＜0.01). Conclusion The cancer cell proliferation,apoptosis and microvessel density may be used as indicators in assessing prognosis for bladder cancer.Preoperative chemoembolization can decrease LI and MVD and increase apoptosis rate in bladder cancer tissue,resulting in the decrease of recurrence rate.