金濤 朱理 趙瓊 方維嘉 曾蕾 彭玲 王一青

檢測(cè)EML4-ALK融合基因?qū)Ψ蜗侔┗颊叩呐R床意義

金濤 朱理 趙瓊 方維嘉 曾蕾 彭玲 王一青

目的 探討檢測(cè)EML4-ALK融合基因?qū)Ψ蜗侔┗颊叩呐R床意義。 方法 收集2012年7至12月手術(shù)或活檢肺腺癌組織標(biāo)本37例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為腺癌，用RT-PCR方法檢測(cè)EML4-ALK融合基因的表達(dá)，設(shè)計(jì)9種探針檢測(cè)EML4-ALK融合基因最常見的9種類型，并隨訪陽(yáng)性患者的治療結(jié)果。結(jié)果 37例腺癌標(biāo)本中，1例檢出EML4-ALK融合基因表達(dá)陽(yáng)性，并經(jīng)測(cè)序法證實(shí)為1型變異，檢出率2.70%。為女性患者，左上肺腫塊，T1N0M0，行左肺上葉肺癌根治術(shù)，術(shù)后給予克唑替尼，隨訪6個(gè)月無復(fù)發(fā)。結(jié)論 使用RT-PCR結(jié)合測(cè)序是一種快速、簡(jiǎn)便、容易推廣的EML4-ALK融合基因檢測(cè)技術(shù)，可以在肺腺癌患者檢測(cè)中推廣使用。

EML4-ALK融合基因 熒光定量PCR 分子診斷 肺腺癌

近年來，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）治療最大的進(jìn)展就是靶向藥物的出現(xiàn)，由于靶向藥物價(jià)格昂貴，故針對(duì)靶向藥物是否有效的檢測(cè)顯得尤為重要。最早的TKI（tyrosine-kinase inhibitor）抑制劑已經(jīng)發(fā)展出了較為成熟的EGFR（epidermal growth factor receptor）檢測(cè)方案。2012年8月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)新的靶向藥物克唑替尼（crizotinib）上市，為提高藥物療效和減少醫(yī)療負(fù)擔(dān)，NCCN也推薦對(duì)擬使用克唑替尼的患者進(jìn)行靶位點(diǎn)棘皮動(dòng)物微管結(jié)合樣蛋白4（echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4）與問變淋巴瘤激酶（anaplas tie lymphoma kinase，ALK）融合基因（EML4-ALK）的檢測(cè)。本研究用RT-PCR法連續(xù)檢測(cè)了37例浙江省的肺腺癌患者腫瘤標(biāo)本，并隨訪陽(yáng)性患者的治療效果，以期探討檢測(cè)EML4-ALK融合基因?qū)Ψ蜗侔┗颊叩呐R床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇浙江省人民醫(yī)院和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心胸外科2012年7至12月手術(shù)切除或經(jīng)胸穿刺活檢，并經(jīng)病理證實(shí)的肺腺癌組織標(biāo)本37例，患者臨床資料齊全，均為首次發(fā)現(xiàn)的胸部腫瘤，術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療和免疫治療。其中男14例，女23例，平均（54.1±5.9）歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 37例肺腺癌患者的腫瘤標(biāo)本（活檢或手術(shù)切除組織，術(shù)后病理證實(shí)為腺癌）用液氮速凍，-80℃冰箱保存。對(duì)其進(jìn)行總RNA提取，利用聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)其EML4-ALK融合基因各亞型的存在情況。利用組織RNA提取試劑盒（杭州寶賽生物技術(shù)有限公司）提取總RNA。提取RNA的質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)體系配制 配制20μl PCR反應(yīng)體系：Real Time PCR Master Mix[東洋紡（上海）生物科技有限公司生產(chǎn)]10μl，各亞型引物（F/R）各0.4μl、探針0.3μl，Enzyme Mix[逆轉(zhuǎn)錄酶ReverTra AceR和RNase Inhibitor的混合酶液，東洋紡（上海）生物有限科技公司] 0.15μl，模板RNA 2μl，最終Nuclease-free Water[未經(jīng)DEPC處理，東洋紡（上海）生物科技有限公司]補(bǔ)足到20μl體系。

1.2.3 探針設(shè)計(jì) 根據(jù)EML4基因斷裂點(diǎn)的不同，常見的EML4-ALK有9種亞型[1-3]。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩查相關(guān)序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)相關(guān)的引物和探針（見表1）。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng)程序 設(shè)置RT-PCR反應(yīng)條件如下：（1）45℃25min；（2）95℃5min；（3）40個(gè)循環(huán)（95℃10s，58℃40s）；（4）收集熒光數(shù)據(jù)：95℃，1min；65℃，30s；95℃，30s。采用一步法檢測(cè)（直接利用RNA作為模版，避免單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄程序），避免繁瑣更換PCR管過程造成污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.5 檢測(cè)EML4-ALK融合基因的RNA表達(dá) 采用37例肺腺癌患者的活檢組織，提取相關(guān)總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。1例標(biāo)本存在EML4-ALK融合基因1型的表達(dá)（圖1）。初步顯示該標(biāo)本中有EML4-ALK融合基因的存在。

圖1 EML4-ALK融合基因1 mRNA表達(dá)圖[注：粗線為內(nèi)參（EIF2A基因），細(xì)線為EML4-ALK融合基因1]

表1 EML4-ALK各亞型相關(guān)引物及探針

1.2.6 EML4-ALK融合基因測(cè)序鑒定 RT-PCR檢測(cè)是一種快速的、敏感的診斷ALK融合基因的方法，需要高純度的mRNA，為了排除融合基因假陽(yáng)性的存在，我們用Sanger測(cè)序法（ABI 3130測(cè)序儀），對(duì)其進(jìn)一步測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果見圖2。

2 結(jié)果

在受檢的37例肺腺癌患者中，1例經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，其EML4-ALK1表達(dá)陽(yáng)性（EML4-exon13/ALK-exon19），并經(jīng)測(cè)序法證實(shí)為變異1型。EML4-ALK融合基因的率為2.70%（1/37）。該EML4-ALK融合基因陽(yáng)性患者為女性，36歲。無吸煙史，左上肺腫塊，T1N0M0，行左肺上葉肺癌根治術(shù)。術(shù)后1個(gè)月開始行克唑替尼治療，隨訪6個(gè)月無復(fù)發(fā)。K-Ras和EGFR（Exon18-21）檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

圖2 EML4-ALK融合基因1型測(cè)序圖（注：EML4-ALK融合基因1型，在EML4基因13號(hào)內(nèi)含子處（即*）與ALK基因20外顯子發(fā)生融合）

3 討論

EML4是棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣蛋白質(zhì)家族成員[4]，它包括一個(gè)N一端基本區(qū)，一個(gè)疏水的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣蛋白域和WD重復(fù)區(qū)。ALK首先在間變性大細(xì)胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)，作為一個(gè)核磷蛋白的融合者，伴隨一個(gè)t（2；5）染色體重排[5]。

EML4-ALK融合蛋白于2007年首次被發(fā)現(xiàn)，Soda等[6]在1例NSCLC患者的組織標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因。EML4和ALK分別位于2p21和2p23，兩者之間相隔約120 000 bp個(gè)堿基對(duì)。2號(hào)染色體短臂易位形成了EML4-ALK融合基因，即EML4不同程度地被截?cái)?，倒置后連接于保留酪氨酸激酶活性的截?cái)郃LK上，就形成了不同的EML4-ALK融合基因，并表達(dá)EML4-ALK融合蛋白[7-9]。根據(jù)EML4的截?cái)嗖课患伴L(zhǎng)短不同，EML4-ALK至少有十余種變異體，而EML4的三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域均在EML4-ALK融合基因異常激活中起重要作用[7，10]。

最常見的變異位點(diǎn)為E13；A20（變異1）及E6a/b；A20（變異3 a/b），在NSCLC中分別占33%和29%[13]，新的變異體也偶見報(bào)道。除了與EML4基因相融合以外，ALK基因在肺癌中還存在和TGF，KIF5B和KLC1等基因相融合的現(xiàn)象[11-12]，本研究設(shè)計(jì)的9種變異體基本涵蓋了EML4-ALK融合基因95%以上的變異體[1，3]。

總體上EML4-ALk融合基因在NSCLC中的檢出率不高，文獻(xiàn)報(bào)道大約在2.7%～6.7%[6，14-15]，其中存在種族差異，當(dāng)然使用的檢測(cè)方法不同也是檢出率不同的重要原因之一。最初學(xué)者們認(rèn)為，EML4-ALK屬NSCLC所獨(dú)有。但2009年，Lin等[16]在其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了EML4-ALK，包括乳腺癌（5/209），結(jié)直腸癌（2/83），及NSCLC（12/106），但仍以NSCLC為最高。

最初的研究者們還認(rèn)為EML4-ALK融合基因和EGFR和K-ras基因突變是排他出現(xiàn)的，但是Tiseo等[17]在2011年報(bào)道了1例同時(shí)具有EGFR突變和EML4-ALK突變的病例，該患者是1例48歲無吸煙史的高加索男性患者，使用EGFR-TKIs（厄洛替尼）治療未有臨床益處。

根據(jù)現(xiàn)有的臨床研究EML4-ALK融合基因出現(xiàn)陽(yáng)性的患者大多具有下列特點(diǎn)：輕度或無吸煙史，年齡相對(duì)較輕，病理類型多為腺癌[18]，因?yàn)镋ML4-ALK融合基因大多出現(xiàn)于肺腺癌患者，故本實(shí)驗(yàn)入選的標(biāo)本全部為病理證實(shí)的腺癌標(biāo)本。

在臨床實(shí)踐中已使用多種技術(shù)來檢測(cè)EML4-ALK融合基因，包括PCR技術(shù)（polymerase chain reaction），免疫組化技術(shù)（immunohistochemistry，IHC），熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等。但是，目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)方法來檢測(cè)NSCLC中的EML4-ALK融合基因。

FISH法是目前比較推薦的方法，但是該方法價(jià)格昂貴，假陽(yáng)性高，需要特殊設(shè)備，不能確定突變的具體類型。RT-PCR法，靈敏、快速、價(jià)格便宜、無需特殊設(shè)備，是一種大部分實(shí)驗(yàn)室均可以開展的EML4-ALK融合基因檢測(cè)技術(shù)，如果結(jié)合陽(yáng)性標(biāo)本的測(cè)序驗(yàn)證，不僅可以排除假陽(yáng)性，還可以獲得具體突變的類型。它的缺點(diǎn)需要設(shè)計(jì)每種類型的引物探針，假陰性可能還是存在的。

本研究第一次在浙江省肺腺癌患者中使用RT-PCR法結(jié)合測(cè)序檢測(cè)了EML4-ALK融合基因的表達(dá)。檢出1例陽(yáng)性，該標(biāo)本出現(xiàn)在第15例患者，估計(jì)在浙江肺腺癌患者中，EML4-ALK融合基因的檢出率為2.7%～5.3%（2/38），這個(gè)比例與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。

我們的研究表明，使用RT-PCR結(jié)合測(cè)序是一種快速、簡(jiǎn)便、容易推廣的EML4-ALK融合基因檢測(cè)技術(shù)，可以在NSCLC標(biāo)本檢測(cè)中推廣使用。

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Detection of EML4-ALK fusion gene in patient with lung adenocarcinoma

EML4-ALK RT-PCR Molecular diagnosis Lung carcinoma

2013-02-05）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省科技廳項(xiàng)目資助（2012C13014-2）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院心胸外科（金濤、朱理）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心胸外科（趙瓊、方維嘉、曾蕾、彭玲）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院（王一青）

【 Abstract】Objective To detect echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4)-anaplastic lymphoma kinase(ALK)fusion gene in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods Biopsy or surgical specimens were collected from 37 patients with pathologically confirmed adenocarcinoma from July 2012 to Dec 2012.The expression of ELM4-ALK fusion gene was detected by RT-PCR with primers designed for 9 subtypes of the fusion gene,and the detected gene was verified by sequencing. Results The expression of ELM4-ALK fusion gene was detected and verified in the surgical specimen from a 36y female patient with T1N0M0lung adenocarcinoma with a detection rate of 2.70%.The radical resection of upper lobe of the left lung was performed and XALKORI was given one month after the surgery.No metastasis was found after 6-months follow-up. Conclusion The detection rate for ELM4-ALK fusion gene is similar as reported in patients with lung adenocarcinoma, and the RT-PCR combined with sequencing is a sensitive and effective method for detection of EML4-ALK fusion gene in surgical or biopsy specimens of patients with lung adenocarninoma.