劉 偉 陶芳標(biāo) 黃德武 王曉紅

(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 安徽合肥 230032)

無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)小鼠因?yàn)椴粩y帶主要潛在感染和條件致病菌以及對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原體而成為國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如何完成普通級(jí)小鼠向SPF級(jí)小鼠的生物凈化是近年來(lái)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作者不斷探索的課題，從最初的藥物凈化嘗試到傳統(tǒng)的剖腹產(chǎn)凈化再到胚胎移植，小鼠的生物凈化技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，實(shí)踐證明新興發(fā)展起來(lái)的超數(shù)排卵-體外受精-胚胎移植技術(shù)具有來(lái)源清晰，遺傳背景明確，胚胎數(shù)量充足的優(yōu)點(diǎn)，并且可以避免病毒、遺傳疾病通過(guò)胎盤(pán)傳染仔鼠，是凈化種群的理想方法［1］，現(xiàn)就該技術(shù)予以綜述。

1 胚胎移植技術(shù)培育SPF級(jí)小鼠的原理

胚胎移植(Embryo Transfer，ET)又稱受精卵移植，它是將體內(nèi)、外生產(chǎn)的小鼠早期胚胎移植到生理狀態(tài)相同的小鼠生殖道內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成正常個(gè)體的生物技術(shù)。母鼠在發(fā)情后，其生殖系統(tǒng)均處于相同的生理狀態(tài)之下，不論受精與否，卵巢都要經(jīng)歷排卵、黃體形成、孕酮分泌、子宮內(nèi)膜增生、分泌機(jī)能增強(qiáng)等相同的生理過(guò)程，妊娠和未孕并無(wú)區(qū)別。所以只要發(fā)情后未配種的受體母鼠所處的發(fā)情周期與移植的胚胎相近，胚胎便可在的其生殖道內(nèi)繼續(xù)發(fā)育并附植;其次，胚胎附植之前處于游離狀態(tài)下離開(kāi)母體，在短時(shí)間內(nèi)可以存活并能進(jìn)行體外培養(yǎng)，當(dāng)重新回到與供體相同的環(huán)境中可以繼續(xù)發(fā)育并發(fā)出妊娠信號(hào)，與受體母鼠建立生理上的聯(lián)系，從而保證以后的正常發(fā)育;另外，受體母鼠對(duì)于具有外來(lái)抗原物質(zhì)的同種胚胎和胎膜組織一般不存在免疫排斥反應(yīng)［2］。小鼠胚胎的透明帶是一道天然屏障，能有效地防止細(xì)菌、病毒的侵入［3］，許多病原體(如淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)不能穿過(guò)透明帶，再加上胚胎在供體體內(nèi)發(fā)育時(shí)間很短，有效的避免了病原體的垂直傳播，同時(shí)胚胎移植的沖洗過(guò)程也有助于減弱或消除病原體的活力［4］，從而增大了對(duì)疾病凈化的可能性，而SPF級(jí)受體小鼠保證了胚胎后期發(fā)育不受病原體感染［5］，這些條件為成功建立新的SPF級(jí)小鼠種群奠定了基礎(chǔ)。

2 胚胎移植技術(shù)培育SPF級(jí)小鼠的發(fā)展現(xiàn)狀

自20世紀(jì)50年代建立了受精卵和早期胚胎的采集技術(shù)之后，日本、美國(guó)率先利用胚胎移植技術(shù)培育出了SPF級(jí)動(dòng)物，我國(guó)從上世紀(jì)80年代由蔣廣泰等人開(kāi)展了小鼠胚胎移植凈化方面的嘗試，在短短30多年的發(fā)展中，小鼠胚胎移植及相關(guān)技術(shù)的研究已相當(dāng)成熟并在生物凈化方面得到了大量運(yùn)用，1995年劉恩岐等在未采用超數(shù)排卵的情況下，將普通級(jí)C57BL/6J近交系小鼠胚胎移植到SPF級(jí)NIH封閉群雌鼠的子宮角內(nèi)獲得成功，在對(duì)仔鼠進(jìn)行了微生物學(xué)檢測(cè)后證實(shí)，通過(guò)胚胎移植可以將普通級(jí)小鼠直接凈化到SPF級(jí)。之后田小利采用輸卵管傘部移植法也獲得成功。1999年都同功等［6］嘗試將胚胎移入輸卵管壺腹部前端，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是不用撕開(kāi)囊膜且膨大的壺腹部易辨認(rèn)，胚胎進(jìn)入輸卵管后順行進(jìn)入膨大部和子宮繼續(xù)發(fā)育，不易漏出和逆行。2005年李瑞生［7］利用胚胎移植技術(shù)對(duì)四種突變無(wú)毛小鼠和一種白內(nèi)障小鼠的桑葚胚進(jìn)行子宮內(nèi)移植，建立了SPF級(jí)特種突變無(wú)毛小鼠和白內(nèi)障小鼠的種質(zhì)資源庫(kù)，為今后更好地研究與開(kāi)發(fā)利用這些種質(zhì)資源提供了良好的研究平臺(tái)。2009年劉麗均［8］采用體外受精-胚胎移植技術(shù)對(duì)L858R、TL小鼠、中華小家鼠和感染肺炎克來(lái)伯氏菌的Balb/c-nu裸鼠進(jìn)行生物凈化，成功建立了這些品系小鼠的SPF級(jí)種群，經(jīng)檢測(cè)，20多種急慢性傳染病均未感染，仔鼠成活率高達(dá)40%。由于清除了疾病，SPF級(jí)小鼠的優(yōu)良性狀得以充分發(fā)揮，利用這種小鼠所開(kāi)展的科研實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和敏感性大大提高。

3 胚胎移植凈化技術(shù)的方法與優(yōu)缺點(diǎn)

胚胎移植生物凈化有兩種方法，一種是從自然交配母鼠子宮中獲取受精卵，然后移植到假孕母鼠體內(nèi)，產(chǎn)仔后達(dá)到生物凈化的目的，但是該方法需要較多的雌雄鼠，不夠經(jīng)濟(jì)節(jié)約，同時(shí)獲取的胚胎數(shù)量有限。另一種方法是采用超排技術(shù)，獲得大量的卵，同時(shí)取1～2只雄鼠采集精子，進(jìn)行體外受精，一次性獲取大量胚胎，這種方法既節(jié)省了動(dòng)物又加速了生物凈化節(jié)奏。隨著眾多生育力和哺育能力低下的突變系小鼠和基因工程小鼠的不斷涌現(xiàn)，體外受精卵移植生物凈化技術(shù)的應(yīng)用也顯得越來(lái)越必要［9］。胚胎移植技術(shù)步驟主要包括供體和受體的準(zhǔn)備、卵子和精子的采集、培養(yǎng)、移植和微生物檢測(cè)等幾個(gè)步驟，而按照胚胎發(fā)育的不同階段，移植部位也不同，1、2細(xì)胞期胚胎在輸卵管部移植［10］，8細(xì)胞期到囊胚期胚胎在子宮部移植。

3.1 經(jīng)典胚胎移植技術(shù)

3.1.1 結(jié)扎雄鼠準(zhǔn)備。選用6～8周齡的雄鼠，在移植前2～3周實(shí)施雙側(cè)輸精管結(jié)扎手術(shù)，并在術(shù)后1周試交配一次以除去輸精管中的余精。

3.1.2 供體小鼠的超數(shù)排卵。實(shí)驗(yàn)第1天15:00給3～5周齡供體雌鼠腹腔注射PMSG(5IU/只)，第3天14:00相同劑量注射HCG后立即與雄鼠1:1交配，第4天8:00～9:00檢栓成功者作為移植供體。

3.1.3 假孕母鼠準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)第4天將受體雌鼠與結(jié)扎雄鼠2:1交配，次日8:00～9:00檢栓成功者作為移植受體。目前國(guó)際上通用的受體母鼠是受孕能力較強(qiáng)、母性較好的ICR小鼠，我國(guó)所特有的KM小鼠從妊娠率及產(chǎn)仔率來(lái)看與ICR小鼠并無(wú)差異，因此KM雌鼠也有較好的受孕能力和代乳能力［11］。

3.1.4 受精卵采集。實(shí)驗(yàn)第5天頸椎脫臼處死供體母鼠，實(shí)施手術(shù)暴露子宮、輸卵管、卵巢和脂肪墊，用剪刀將輸卵管和卵巢分離，并將子宮角剪下，固定輸卵管傘部，將吸有沖胚液的注射器插入傘部，推動(dòng)注射器將輸卵管及子宮內(nèi)的胚胎沖出，用吸卵管將形態(tài)優(yōu)良的胚胎挑出并在沖胚液中轉(zhuǎn)移3次，最后用移植管吸入15～20枚胚胎備用。

3.1.5 胚胎移植。①輸卵管膨大部移植法。將受體鼠置于超凈臺(tái)中麻醉，實(shí)施手術(shù)拉出卵巢、輸卵管和子宮，移入顯微鏡下，在輸卵管傘端至壺腹部之間靠近壺腹部1/3處的輸卵管壁上用5號(hào)針頭穿一小洞，并用鑷子固定開(kāi)洞附近邊緣，把移植管插入洞口并將8～10枚2細(xì)胞期胚胎吹入輸卵管膨大部，再將子宮、輸卵管回位，同樣方法移植另一側(cè)輸卵管后，縫合肌肉、皮膚，最后將受體鼠放在55℃熱臺(tái)上復(fù)蘇后送回SPF級(jí)動(dòng)物房待產(chǎn)仔。②輸卵管傘口移植法。體視顯微鏡下拉出卵巢部，剪開(kāi)卵巢膜，找到輸卵管傘，將1細(xì)胞期胚胎經(jīng)受體母鼠輸卵管傘口移植入受體母鼠輸卵管中。③子宮移植法。體視顯微鏡下拉出子宮，用顯微鑷子輕輕夾住子宮與輸卵管結(jié)合部使子宮與鼠體成45°角，用5號(hào)針頭在子宮壁穿一小洞，沿著針眼將移植管扎入并輕輕將8細(xì)胞期或囊胚期胚胎吹入子宮內(nèi)，還納子宮，縫合并消毒。

3.2 體外受精-胚胎移植技術(shù)

3.2.1 體外受精。取2～3只6～8周齡雄鼠，頸椎脫臼處死后打開(kāi)腹腔，分離兩側(cè)睪丸及附睪，從附睪上體尾部挑出精子團(tuán)塊，移入HTF培養(yǎng)基中，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱獲能2h。同品系母鼠超數(shù)排卵處理14h后頸椎脫臼處死，打開(kāi)腹腔，分離輸卵管，從輸卵管壺腹部取出卵母細(xì)胞團(tuán)，移入HTF微滴中，加入5～10μL精子(200個(gè)精子/μL)，放入CO2培養(yǎng)箱受精6h后洗卵，再培養(yǎng)過(guò)夜至2細(xì)胞期胚胎生成。研究結(jié)果表明，ICR、KM、CD1封閉群小鼠的體外受精率及形態(tài)正常的2細(xì)胞胚胎移植后的產(chǎn)仔率高于近交系小鼠和疾病模型小鼠［12］。

3.2.2 胚胎移植。2細(xì)胞期胚胎采用輸卵管內(nèi)移植法移植至假孕0.5d的母鼠輸卵管內(nèi)，兩側(cè)輸卵管各移植8～10枚胚胎。

3.3 產(chǎn)仔及微生物檢測(cè) 母鼠產(chǎn)仔后，哺乳到仔鼠離乳，隨機(jī)抽取一只仔鼠和母鼠，按照GB/T18448·1-2001寄生蟲(chóng)學(xué)檢測(cè)方法和GB14922·1-2001進(jìn)行寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè);按照GB/T14926·42-2001細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法和GB14922·2-2001進(jìn)行細(xì)菌學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè);按照GB/T14926·18～32;50～64-2001病毒學(xué)檢測(cè)方法和GB14922·2-2001進(jìn)行病毒學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)。分離血清，用于病毒、細(xì)菌及寄生蟲(chóng)抗體檢測(cè)。采集氣管分泌物、腸內(nèi)容物、臟器分離細(xì)菌，檢測(cè)體內(nèi)寄生蟲(chóng)。采集肛拭子進(jìn)行細(xì)菌分離。根據(jù)微生物檢測(cè)結(jié)果判定凈化成功與否。

4 移植凈化SPF級(jí)小鼠應(yīng)注意的事項(xiàng)

4.1 胚胎的質(zhì)量 優(yōu)良胚胎的形態(tài)典型，卵細(xì)胞和分裂球的輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)致密，色調(diào)和分布均一。通常封閉群和F1代雌鼠作為供體雌鼠時(shí)，因其雜交優(yōu)勢(shì)的體現(xiàn)，胚胎的質(zhì)量和生命力高，異常卵比例低于各種近交系雌鼠的胚胎，且生育能力有所增強(qiáng)，產(chǎn)仔數(shù)多，因此移植成功率較高［13］。

4.2 胚胎存放時(shí)間 小鼠胚胎隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其活力大大下降，因此胚胎在體外培養(yǎng)的時(shí)間愈短愈好。傳統(tǒng)胚胎移植術(shù)則要求胚胎從輸卵管沖出后盡快進(jìn)行形態(tài)鑒定并撿洗胚胎，避免顯微鏡熱燈光長(zhǎng)時(shí)間的炙烤［14］。其次在沖胚液中要加入適量的新生牛血清以防胚胎下沉后與平皿底部貼壁。另外檢洗胚胎的移植針斷端應(yīng)平整并將斷口拂過(guò)火焰使其受熱變光滑，這樣在使用中不會(huì)劃傷胚胎，也不會(huì)在虹吸時(shí)帶入多余的液體。

4.3 供受體同步發(fā)情 供體小鼠發(fā)情與受體小鼠發(fā)情的同步性是決定胚胎能否移植成功的關(guān)鍵，理論上供體與受體的發(fā)情時(shí)間應(yīng)完全同步，但是因?yàn)橐浦埠蟮呐咛ピ谑荏w鼠生殖道內(nèi)有一定的恢復(fù)時(shí)間，所以一般受體鼠與結(jié)扎公鼠的合籠時(shí)間安排的比供體鼠的見(jiàn)栓時(shí)間晚12小時(shí)左右［15］。

4.4 無(wú)菌控制水平 在進(jìn)行胚胎移植手術(shù)的整個(gè)過(guò)程中，一定要注意無(wú)菌控制，從小鼠的微生物級(jí)別、麻醉、解剖、采集、體外受精、培養(yǎng)、洗滌、裝管、移植直至縫合、后期護(hù)理等所有環(huán)節(jié)都要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌化操作，無(wú)論是對(duì)供體、受體的污染還是對(duì)精子、卵子、受精卵的污染，都會(huì)對(duì)降低胚胎質(zhì)量和移植妊娠率。大量研究表明病原體污染和操作污染是造成胚胎死亡和早期妊娠中斷的主要原因［16］，同時(shí)操作水平的高低會(huì)直接影響移植妊娠率，熟練的操作者手法輕柔迅捷，可大大縮短操作時(shí)間，減少對(duì)生殖系統(tǒng)和胚胎的不良刺激。

4.5 移植時(shí)期和移植部位 大量研究證實(shí)，2細(xì)胞期胚胎進(jìn)行輸卵管膨大部移植的成功率高于1細(xì)胞期胚胎的輸卵管傘部移植和8細(xì)胞期的子宮移植，其原因不僅是2細(xì)胞胚胎狀態(tài)比較穩(wěn)定，細(xì)胞質(zhì)量較好，易著床，另外還是由于輸卵管傘口包裹于卵黃囊膜內(nèi)，囊膜開(kāi)口的位置隱蔽，剪開(kāi)卵黃囊尋找傘口時(shí)會(huì)分泌許多組織液及血液，既影響視野也容易堵塞移卵管。而采用輸卵管膨大部移植法降低了移植難度，克服了傘口移植的困難，易于操作，胚胎進(jìn)入輸卵管后順行進(jìn)入膨大部繼續(xù)發(fā)育，不易漏出和逆行［17］。8細(xì)胞期胚胎由于在體外培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)因而總體受孕成功率比輸卵管移植較低。當(dāng)然，移植的胚胎數(shù)量也不能過(guò)多，如單側(cè)移植每次不能超過(guò)10枚，雙側(cè)移植不能超過(guò)25枚，移植太多可導(dǎo)致胚胎發(fā)育不均衡，造成胚胎器官和神經(jīng)發(fā)育障礙同時(shí)對(duì)受體健康不利。

5 小結(jié)

胚胎移植技術(shù)作為一項(xiàng)新興發(fā)展起來(lái)的生物凈化手段，與傳統(tǒng)的剖腹產(chǎn)和藥物凈化技術(shù)相比確有其優(yōu)勢(shì)，如凈化效果明顯、結(jié)果可靠，避免了剖腹產(chǎn)成活率低、手術(shù)時(shí)間難以掌握，病原體通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播等缺點(diǎn)。但目前我國(guó)胚胎移植的成功率還不是很高，大約只有40%左右，而上世紀(jì)末，國(guó)外的胚胎移植成功率已達(dá)60%以上。因此我要進(jìn)一步加強(qiáng)胚胎移植相關(guān)技術(shù)的深入研究，如加強(qiáng)超數(shù)排卵技術(shù)方案的研究，提高超排效果，產(chǎn)生更多可用胚胎，有效解決胚胎來(lái)源問(wèn)題;加強(qiáng)體外受精研究，改進(jìn)受精卵培養(yǎng)和挑選方法，使用顯微操作受精，提高體外受精成功率;加強(qiáng)胚胎移植操作方法研究，簡(jiǎn)化技術(shù)操作環(huán)節(jié)，解決輸卵管出血、破漏、逆行等問(wèn)題;加強(qiáng)胚胎分割技術(shù)、性別控制技術(shù)等研究;積極開(kāi)展胚胎移植技術(shù)的培訓(xùn)工作，建立胚胎移植技術(shù)隊(duì)伍，促進(jìn)胚胎移植技術(shù)推廣應(yīng)用。我們相信，隨著各環(huán)節(jié)工作的不斷完善，胚胎移植的成功率將會(huì)迅速提高，胚胎移植生物凈化將成為目前培育SPF級(jí)小鼠的首選技術(shù)。

［1］張 麟，潘 紅，王 眩.應(yīng)用胚胎移植及相關(guān)技術(shù)培SPF香豬的研究進(jìn)展［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2011，35(6):14

［2］張 寅，伍瓊芳.人類輔助生殖技術(shù)的臨床研究進(jìn)展［J］.國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2012，31(2):108

［3］龍家茹，孫 戈.動(dòng)物卵母細(xì)胞透明帶與受精的關(guān)系［J］.井岡山學(xué)院學(xué)報(bào):綜合版，2008，29(8):61

［4］Singh V，Goh B T，Smith G W，et a1.Penicillin concentrations in serum and cerebrospinal fluid after intramuscular injection of aqueous procaine penicillin 0.6 MU with and without probenecid［J］.Br J Veneer Dis，2007，60(6):371

［5］李愛(ài)學(xué)，尚世臣，曾 林，等.SPF級(jí)KM小鼠繁殖及生長(zhǎng)發(fā)育性能測(cè)定［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2009，(5):317

［6］都同功，陳系古，俞 生，等.一種胚胎移植新方法的建立［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜，1999，9(1):6

［7］李瑞生，董 罡，孔德強(qiáng)，等.胚胎移植技術(shù)對(duì)特種突變小鼠的凈化研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13(4):239

［8］劉麗均，郁麗麗，朱權(quán)鳳，等.生物工程技術(shù)在實(shí)驗(yàn)小鼠生物凈化上的應(yīng)用［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(11):64

［9］陳通克，陳錫文.利用體外受精-胚胎移植技術(shù)對(duì)ALK3基因敲除小鼠進(jìn)行保種鑒定［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，2011，(1):11

［10］陳 愷，肖 雄，武建中，等.昆明小鼠胚胎輸卵管移植技術(shù)研究［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009，5(26):1

［11］彭禮繁，羅光彬.昆明小鼠胚胎移植技術(shù)的研究［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2008，4(25):55

［12］徐 平，山村綾子，唐一岷，等.不同品系小鼠的體外受精、胚胎冷凍及移植的比較研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2004，12(3):147

［13］于天飛，徐興軍，楊曉杰，等.動(dòng)物胚胎工程研究［J］.生物學(xué)教學(xué)，2011，8(36):2

［14］周懂杰，蘇賀靖，張 杰，等.洗胚對(duì)小鼠胚胎質(zhì)量影響初探［J］.中外醫(yī)療，2010，18:30

［15］況 玲，郭慶勇，武聚富，等.小鼠胚胎移植實(shí)驗(yàn)方法［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2008，25(1):65

［16］李同豹，梁 坤，韓永勝，等.影響牛胚胎移植妊娠率的主要因素［J］.中國(guó)奶牛，2003，3:39

［17］左 琴，范昌發(fā)，胡培麗，等.小鼠2細(xì)胞期胚胎移植方法的探討［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，8(17):28