劉亞舉，張俊濤

法醫(yī)DNA檢驗(yàn)檢材主要來(lái)源于案件現(xiàn)場(chǎng)和人員生物樣本。案件生物樣本附有高度可變的載體，DNA濃度低、質(zhì)量差、類型陳舊、易混合，而人員樣本是可預(yù)測(cè)的高濃度高質(zhì)量DNA、有標(biāo)準(zhǔn)化載體進(jìn)行采樣、類型新鮮、來(lái)源單一。隨著DNA檢驗(yàn)試劑盒的增多，針對(duì)以上不同的樣本需要采取不同的應(yīng)對(duì)措施。本文介紹幾種DNA試劑盒在人員血樣檢驗(yàn)中的應(yīng)用，也是作者的使用體會(huì)，以供大家參考。

1 STR熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒發(fā)展歷程

1997年11月，F(xiàn)BI確立CODIS系統(tǒng)，包含13個(gè)核心基因座(CSF1PO，F(xiàn)GA，TPOX，TH01，vWA，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11)和性別基因座Amelogenin。2000年5月，美國(guó)Promega公司研制出了PowerPlex 16試劑盒，增加了2個(gè)五核苷酸基因座Penta D和Penta E；2001年7月，美國(guó)AB公司開發(fā)出了Identifiler試劑盒，增加了2個(gè)四核苷酸基因座D2S1338和D19S433。隨后熒光復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)試劑盒被應(yīng)用于相關(guān)的領(lǐng)域，不同的是Identifiler試劑盒系5色熒光標(biāo)記技術(shù)，而PowerPlex 16試劑盒系4色熒光標(biāo)記技術(shù)。2007年之后，國(guó)產(chǎn)STR熒光復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)試劑盒也出現(xiàn)，主要在CODIS系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，選擇Penta D、Penta E、D2S1338、D6S1043，D12S391和D19S433等基因座。

歐洲標(biāo)準(zhǔn)(ESS)推薦的是FGA、TH01、vWA、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11、D12S391、D1S1656、D2S441、D10S1248、D22S1045和Amelogenin?，F(xiàn)在歐洲標(biāo)準(zhǔn)(ESS)增加了D16S539、D2S1338、D19S433和SE33等基因座。最近，美國(guó)FBI對(duì)CODIS基因座重新進(jìn)行了評(píng)估升級(jí)，并最終確立了含20個(gè)STR基因座的擴(kuò)展核心基因座[1-2]。Identifiler試劑盒除TPOX外的15個(gè)基因座和D1S1656、D2S441、D10S1248、D12S391、 DYS391基因座，并推薦TPOX、D22S1045和SE33為備選基因座。

2 不同試劑盒在人員血樣檢驗(yàn)中應(yīng)用

2.1Identifiler系列(美國(guó)AB公司) 這是一款經(jīng)久不衰的檢驗(yàn)試劑盒，在系列試劑盒中使用相同的引物序列，革新技術(shù)亮點(diǎn)是引入非核苷酸連接物修正遷移率，這樣可以使不同基因座的兩個(gè)相距很近的產(chǎn)物片段的位置相對(duì)移動(dòng)，從而防止片段重疊。Stutter產(chǎn)物、非模板添加、雜峰和偽峰等都不明顯，峰型尖銳清晰、平衡性好[3]。尤其是現(xiàn)在的GlobalFiler試劑盒，不僅涵蓋了新CODIS系統(tǒng)基因座及所推薦基因座，還增加了Y indel基因座，并且采用6色熒光標(biāo)記技術(shù)，使得10個(gè)Mini STR基因座在220 bp以下，40 min即可完成PCR擴(kuò)增。作者在使用GlobalFiler進(jìn)行直接擴(kuò)增時(shí)，不管是晾干的新鮮或是陳舊紙質(zhì)血樣，1.2 mm圓孔血樣均能成功，峰值范圍為2 000～8 000 RFU，雜合子兩個(gè)峰高比例>70%，同一熒光基因座峰高比例>50%；3500 XL電泳時(shí)，內(nèi)標(biāo)(LIZ500或LIZ600)和甲酰胺是1∶50左右。

2.2PowerPlex系列(美國(guó)Promega公司) 它是老牌的STR試劑代表者，革新技術(shù)亮點(diǎn)是首先引入五核苷酸基因座Penta D和Penta E，但在系列試劑盒不同版本中相同的基因座要改變引物序列，才能防止片段重疊。另外，在PowerPlex 16HS試劑盒中，克服PCR抑制劑如血紅素、腐殖酸和單寧酸等方面表現(xiàn)了卓越性能，將擴(kuò)增酶混合在Master Mix中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)檢材的直接擴(kuò)增，開創(chuàng)了直接擴(kuò)增的先河[3]。目前的代表試劑盒是PowerPlex Fusion，其基因座與GlobalFiler試劑盒略有不同，將 Penta D、Penta E代替了SE33和Y indel基因座，PCR擴(kuò)增時(shí)間約60 min。在該系列直接擴(kuò)增試劑盒中，需要將晾干的新鮮紙質(zhì)血樣水洗或陳舊化處理(如擴(kuò)增儀95℃、5 min)，作者使用PowerPlex 21試劑盒進(jìn)行直接擴(kuò)增時(shí)，1.2 mm圓孔血樣峰值范圍為400～3 000 RFU、雜合子兩個(gè)峰高比例>70%，同一熒光基因座峰高比例>50%；3130 XL電泳時(shí)，內(nèi)標(biāo)(ILS500)和甲酰胺是1∶15～20左右。

2.3Investigator系列(德國(guó)Qiagen公司) 主要面向歐洲市場(chǎng)，因此按照ESS標(biāo)準(zhǔn)選擇基因座，其中Investigator ESSplex SE Plus Kit滿足ESS的17個(gè)基因座。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室主要應(yīng)用Investigator HDplex和Argus X-12試劑盒進(jìn)行親子鑒定的補(bǔ)充檢驗(yàn)[4-6]。在HDplex試劑盒中，需要注意的是基因座D10S2325和SE33的等位基因檢測(cè)范圍非常接近，D10S2325檢測(cè)到等位基因20和20.1，會(huì)出現(xiàn)在SE33的等位基因檢測(cè)范圍，因此對(duì)于出現(xiàn)在這2個(gè)基因座等位基因檢測(cè)范圍內(nèi)的可識(shí)別的峰型需要仔細(xì)判讀[4]。作者沒(méi)有采用直接擴(kuò)增，而是按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取[6]；3130 XL電泳時(shí)，內(nèi)標(biāo)(BTO-550)和甲酰胺是1∶20左右。

2.4DNATyper15系列(公安部物證鑒定中心) 它是國(guó)產(chǎn)試劑盒的杰出代表[7]，前期不包含CODIS系統(tǒng)的TPOX、TH01，增加了Penta E、D2S1338和D6S1043共15個(gè)基因座，后期的DNATyper15 Plus試劑盒，又包含TPOX、TH01、D12S391和D19S433等4個(gè)基因座。無(wú)論是晾干的新鮮或是陳舊紙質(zhì)血樣(FTA卡需水洗一遍)[8]。作者進(jìn)行直接擴(kuò)增時(shí)，1.2 mm圓孔血樣得到的STR分型峰形尖銳清晰且平衡性好；3500 XL電泳時(shí)，內(nèi)標(biāo)和甲酰胺是1∶20左右。

2.5AGCU系列(無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司) 該系列試劑盒涵蓋范圍廣泛，既有常規(guī)染色體又有性染色體(X、Y-STR)基因座，其中AGCU21+1和X-12試劑盒也是進(jìn)行親子鑒定的補(bǔ)充檢驗(yàn)，另外就是AGCU Ex22(在DNATyper15 Plus試劑盒上增加了Penta D、D2S441和D10S1248)，添加DYS391基因座就變?yōu)镋x23試劑盒[9]。作者進(jìn)行直接擴(kuò)增時(shí)，將晾干的新鮮紙質(zhì)血樣水洗或陳舊化處理(如擴(kuò)增儀95℃、5 min)，1.2 mm圓孔血樣就能成功，峰值范圍為400～7 000 RFU，雜合子兩個(gè)峰高比例>70%，但發(fā)現(xiàn)有Stutter產(chǎn)物、檢測(cè)基線跳躍現(xiàn)象；3130 XL電泳時(shí)，內(nèi)標(biāo)(SIZ500)和甲酰胺是1∶25～30左右。。

2.6STRtyper系列(珠海科登生物工程有限公司) 原先的STRtyper-10G/F試劑盒經(jīng)常被應(yīng)用在親子鑒定中[10]，為了適應(yīng)需求，研制出了STRtyper-21G，含有DNATyper15 Plus試劑盒的19個(gè)基因座和D1S1656、Penta D基因座。無(wú)論是晾干的新鮮或是陳舊紙質(zhì)血樣都可以進(jìn)行直接擴(kuò)增。作者在使用過(guò)程中，F(xiàn)TA卡需要采用0.5 mm，其它應(yīng)采用1.2 mm圓孔，得到的STR分型峰形尖銳清晰且平衡性好，但有Stutter產(chǎn)物、檢測(cè)基線跳躍現(xiàn)象；3130 XL電泳時(shí)，可以借用AB的G5，內(nèi)標(biāo)LIZ500和甲酰胺是1∶50左右。

2.7Goldeneye系列(北京基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)有限公司) 在國(guó)產(chǎn)STR試劑盒中最先采用直接擴(kuò)增技術(shù)，經(jīng)典代表為Goldeneye20A，在DNATyper15 Plus試劑盒基因座上添加了Penta D。在進(jìn)行直接擴(kuò)增時(shí)，需將晾干的新鮮紙質(zhì)血樣水洗或陳舊化處理(如擴(kuò)增儀95℃、5 min)、FTA卡需水洗一遍，1.2 mm圓孔血樣均能成功，峰值范圍為800～8 000 RFU，雜合子兩個(gè)峰高比例>70%[11]，但有Stutter產(chǎn)物、檢測(cè)基線跳躍現(xiàn)象；3130 XL電泳時(shí)，內(nèi)標(biāo)(Orange500)和甲酰胺是1∶10～15左右。

3 總結(jié)

隨著技術(shù)的發(fā)展，法醫(yī)DNA檢驗(yàn)試劑盒主要解決以下問(wèn)題：①STR基因座數(shù)量和遺傳多態(tài)性：基因座的數(shù)目應(yīng)該滿足系統(tǒng)效能，而且應(yīng)相互獨(dú)立；遺傳多態(tài)性要滿足DP>0.9、H>0.7[12]，以及低stutter產(chǎn)物、低突變率。在不同的種族、地區(qū)和人群中，STR基因座頻率具有明顯的差異，因此不同的STR基因座往往被選擇性地使用。但是，在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行親緣關(guān)系比對(duì)時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)Identifiler與PowerPlex 16試劑盒的13個(gè)基因座符合親緣關(guān)系，雙方實(shí)驗(yàn)室使用PowerPlex 16試劑盒進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)后，反而排除親緣關(guān)系。也就是說(shuō)Penta D、Penta E基因座在中國(guó)人群中具有很高的個(gè)體識(shí)別力和非父排除率。按照目前國(guó)內(nèi)有關(guān)學(xué)者的建議[13]，Penta D和Penta E基因座應(yīng)納入核心基因座。關(guān)于SE33基因座具有高度多態(tài)性，其內(nèi)部序列結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜[14]，具體情況還需進(jìn)一步使用觀察。②樣本的檢出成功率：首先是抑制因素，如血紅素等，主要體現(xiàn)在STR擴(kuò)增過(guò)程酶的活性等。其次是電泳檢測(cè)時(shí)內(nèi)標(biāo)的特性和濃度等。第三是檢驗(yàn)總時(shí)間，主要是擴(kuò)增時(shí)間的縮短改變。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bulter JM,Hill CR.Biology and genetics of new autosomal STR loci useful for forensic DNA analysis[J]. Forensic Sci Rev，2012,24(1):16-26.

[2]Hares DR.Expanding the CODIS core loci in the United States[J]. Forensic Sci Int Genet, 2012, 6(1): 52-54.

[3]巴華杰，林子清，劉亞楠，等.5種免提取試劑盒檢驗(yàn)濾紙血痕結(jié)果的比較[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2013,28(1)：49-51.

[4]張素華，張喆人，孫寬，等.Investigator HDplex試劑盒在華東漢族人群中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2012,28(5)：351-354.

[5]張素華，朱如心，李莉，等.Investigator Argus X-12試劑盒在華東漢族人群中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評(píng)估[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2011,27(5)：365-368.

[6]劉亞舉，蘇偉民，岳俊濤，等.河南漢族人群12個(gè)X-STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2013,29(4)：297-299.

[7]趙興春，姜成濤，葉健，等.DNATyperTM15試劑盒的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2008,23(3)：169-171.

[8]張建，姜成濤，趙興春，等.DNA TyperTM15試劑盒直接擴(kuò)增檢驗(yàn)紙質(zhì)樣本的研究[J].刑事技術(shù)，2011(4)：33-35.

[9]唐建新,李雙琳,劉宏,等.23個(gè)STR基因座熒光復(fù)合擴(kuò)增體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評(píng)估[J].中國(guó)司法鑒定，2013(1)：98-101.

[10]楊榮芝，梅焜，馬麗莉，等.STR-typer 10G/F試劑在單親鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2013,28(1)：11-14.

[11]劉亞舉，史紹杏，魏鵬飛，等. GoldeneyeTM16C系統(tǒng)在批量血樣DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2013,29(1)：55-56.

[12]Gill P. A new method of STR interpretation using inferential logic development of a criminal intelligence database[J].Int J Leg Med,1996,109(1):14-22.

[13]伍新堯.高級(jí)法醫(yī)學(xué)[M].2版..鄭州：鄭州大學(xué)出版社,2011：426-427.

[14]Hering S,Edelmann J,Dressler J.Sequence variations in the primer binding regions of the highly polymorphic STR system SE33[J].Int J Legal Med,2002,116(6):365-367.