陳宏偉，朱蘊蘭，高兆建，張 城

（1.徐州工程學(xué)院，江蘇徐州 221111；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點實驗室，江蘇徐州221111；3.江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇徐州221111）

木耳（Auricularia auricula），又稱黑木耳，在生物分類學(xué)上屬于真菌門，擔子菌綱，木耳目，木耳科，是人類常見的食用菌之一，其色澤黑褐，質(zhì)地柔軟，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，易于消化，老少皆宜，不僅可以作為食用，而且還可以作為藥用。木耳含有多種營養(yǎng)物質(zhì)如：糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、鐵、鈣、磷、核酸、粗纖維等成分。它具有益氣強身、益智健腦、強精補腎、清肺益氣、鎮(zhèn)靜止痛、舒筋活絡(luò)、滋陰潤燥之功效，還具有降低血壓、血脂、抗凝血、抗血栓、抗輻射、抗衰老、消炎和增強機體免疫功能的作用，而且能促進核酸、蛋白質(zhì)的生物合成和防治多種老年性疾病的發(fā)生，并具有一定的抗腫瘤和治療心血管疾病的功效[1-2]。鍺屬于稀有元素，在土壤、植物中的含量較低，且具有毒性。研究發(fā)現(xiàn)，有機鍺是一種廣譜性的藥物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老，具有消炎與免疫調(diào)節(jié)等作用，對微生物的生長、改善血液循環(huán)、增加攜氧量有促進作用[3]。食用菌菌絲體對鍺富集能力較強，可以使無機鍺通過菌絲體的轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化為有機鍺，降低毒性，增加有機鍺的利用率，提高鍺的生物效應(yīng)，并可改善食用菌的品質(zhì)。有關(guān)食用菌對鍺富集的研究已有一些[4-5]，但木耳對鍺的富集研究尚未見報道，本研究試圖通過木耳的生物轉(zhuǎn)化作用將無機鍺轉(zhuǎn)化為有機鍺，并研究富鍺木耳對小鼠腸道菌群的影響，為進一步開發(fā)木耳產(chǎn)品，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木耳（Auricularia auricula） 江蘇徐州豐縣大山河食用菌生產(chǎn)基地；大腸桿菌和乳酸桿菌 徐州工程學(xué)院實驗室保藏；昆明小鼠（kunming mice） 徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；斜面培養(yǎng)基 葡萄糖4%、酵母膏1%、蛋白胨1%、瓊脂2%、去離子水；液體種子培養(yǎng)基葡萄糖3%、蛋白胨1%、麥麩1%、豆粉1%、硫酸鎂0.15%、磷酸二氫鉀0.2%、氧化鍺（350μg/mL）、去離子水；發(fā)酵培養(yǎng)基 同液體種子培養(yǎng)基；鍺標準液 國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；氧化鍺 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

HYG-Ⅱ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動化有限公司；GPH-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒精密儀器有限公司；GZX-DH40X45-BC型電熱恒溫干燥箱 上海躍進電器器械廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 華國電器有限公司；FA-210N型電子分析天平 上海精密器械有限公司；YXQ-SG41-280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子設(shè)備廠；82-1型低速離心機 常州國華電器有限公司；PHS-3CA型酸度計 上海世義精密儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工有限公司；XT-9900型智能微波消解儀 中國上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；XT-9700型冷卻機 中國上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；XT-9800型多用預(yù)防處理加熱儀 中國上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；3-30K型高速離心機

德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木耳富鍺培養(yǎng) 活化后的菌種→斜面培養(yǎng)（23℃，5～7d）→搖瓶種子培養(yǎng)（250mL三角瓶裝樣量100mL，23℃，120r/min，5～7d）→富鍺擴大培養(yǎng)（10%的接種量接入含鍺的發(fā)酵培養(yǎng)基，23℃，120r/min，5～7d）。

1.2.2 木耳菌絲體干粉的制作 將發(fā)酵液經(jīng)減壓抽慮得到菌絲體，然后將菌絲體置于50℃干燥箱中干燥至恒重，研磨成粉末，裝入小塑料袋，放入干燥器內(nèi)備用。

1.2.3 木耳菌絲體生物量的測定 將發(fā)酵液抽濾得菌絲體，經(jīng)干燥至恒重，稱量，即為生物量。

1.2.4 木耳菌體中有機鍺含量測定 a.菌絲粉用透析袋透析2d，每天換2～3次水，將其中的無機鍺透析掉[6]。b.微波消解（微波消解階段設(shè)置：功率為80%，壓力為10kPa，第一階段時間300s），得到消解液于冷卻機中趕酸30min，定容到10mL容量瓶中，待測[7]。c.鍺含量測定用TAS-990型火焰原子吸收分光光度計（波長265.2nm，工作電流5mA，燃氣流量2000mL/min，燃燒高度5.0mm，負高壓350V，光譜帶寬0.4nm）測定其吸光度，并通過標準回歸方程計算該樣品中有機鍺的含量[8]。d.鍺標準曲線繪制：于10mL容量瓶內(nèi)準確取1mL鍺標準溶液，加1%硝酸定容。分別取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于1mL容量瓶中，加5μg基體改進劑硝酸鎳[9]，用1%硝酸定容，用上述方法c測定，并求回歸方程。

1.2.5 小鼠實驗分組 將30只小鼠分成三組，第一組（10只）：小鼠正常飲食；第二組（10只）：灌胃生理鹽水（每只每天1次0.2mL，喂21d）；第三組（10只）：灌胃富鍺木耳菌絲體（每只每天1次富鍺木耳菌絲體75mg/0.2mL，灌胃21d）。

1.2.6 腸道糞便菌群樣品的收集 在灌胃之前和灌胃后第21d分別在無菌條件下輕輕地擠壓小鼠的直腸部位，收集新鮮的小鼠糞便。并將收集的小鼠糞便裝于先前滅菌好的EP管中，每組的實驗小鼠收集3個糞便標本。迅速將EP管封口，記錄重量，-20℃冷凍保存[10]。

1.2.7 糞便樣品中DNA提取和純化 a.DNA的提取按照楊美芬等[11]的方法，在糞便樣本中加入9倍的體積PBS溶液（0.05mol/L，p H7.4）中充分混勻，低速離心（1500r/min 5min），取上清，并重復(fù)上述過程3次，合并上清液。然后高速離心（10000r/min 3min）后取沉淀，沉淀用PBS洗3次，水洗一次，加入50μL水和50μL 1%TritonX-100，100℃煮沸5min立即投入事先準備的冰凍水中，以備后面使用。b.DNA的純化 將上述提取步驟中所得液體進行高速離心（14000r/min 1min）取上清液，接著加入相同體積的4℃的酚和三氯甲烷，振蕩10s，再高速離心10min取出上清液，接著加入2～2.5倍4℃ 95%乙醇，液氮冷凍20min，接著用高速離心機離心1min，取出沉淀，用無水乙醇重復(fù)進行上述步驟，再沉淀一次，待揮干乙醇后，加入50μL的TE，放入冰箱中于-20℃保存。

1.2.8 DNA標準品的制備 取培養(yǎng)好的大腸桿菌和乳酸菌菌液，用血球計數(shù)板確定濃度（大腸桿菌濃度為4.0×107cfu/mL，乳酸菌濃度為1.8×107cfu/mL）取1mL菌液，10000r/min離心3min，PBS清洗，破碎，純化步驟同1.2.7（b）。

1.2.9 熒光定量PCR反應(yīng)

1.2.9.1 引物的設(shè)計 根據(jù)大腸桿菌的16S rDNA基因序列設(shè)計大腸桿菌菌種特異性PCR引物，并在BLAST基因庫上進行比較[11]。

1.2.9.2 引物特異性 取DNA標準品和之前收集好的糞便樣品DNA進行常規(guī)的PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μL：10×Buffer 2.5μL，0.25mol/L 4×dNTP 0.5μL，25mmol/L MgCl22.5mL，2μmol/L上下游引物各0.5μL，5U/μL Taq酶0.15μL，DNA模板3μL，水15.35μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 5min后，95℃ 15s，55℃ 1min，72℃45s共35個循環(huán)，最后72℃[12]10min結(jié)束。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.10 標準曲線的制作 將所得DNA做10倍系列稀釋，進行SYBR GreenⅠ作為實時定量PCR反應(yīng)的熒光染料。反應(yīng)的體系25μL：SYBR Premix Ex Taqtm 12.5μL，ROXReference Dye 0.5μL，上游和下游的引物各0.5μL，模板2μL，水9μL。同時采用ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System來擴增。反應(yīng)的程序為：在95℃下預(yù)變性5min后，95℃ 15s，60℃ 1min，80℃10s，進行40個循環(huán)。待反應(yīng)完成后，溫度從60℃到95℃緩慢的升溫，并檢測熒光數(shù)據(jù)。根據(jù)讀取的上述熒光數(shù)據(jù)，運用系統(tǒng)軟件自動分析Ct值，自動生成相應(yīng)的標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 富鍺木耳菌絲體有機鍺含量

經(jīng)測定，獲得的鍺標準回歸方程為y=0.065x+0.0037，R2=0.9826，根據(jù)標準回歸方程測得木耳菌絲體有機鍺含量為536.3μg/g。

2.2 小鼠腸道菌群DNA的PCR擴增結(jié)果

小鼠腸道大腸桿菌和乳酸桿菌的DNA擴增產(chǎn)物結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出引物的特異性很好，糞便樣品中的大腸桿菌和乳酸桿菌的DNA擴增結(jié)果與標準品DNA擴增的結(jié)果有極高的吻合度，可以作為熒光定量PCR引物使用。

2.3 富鍺木耳對小鼠腸道大腸桿菌及乳酸桿菌數(shù)量的影響

經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)，大腸桿菌和乳酸桿菌16S rDNA的數(shù)量標準曲線如圖2和圖3所示。

將糞便DNA樣本分別進行2種細菌的16S rDNA熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系與標準曲線一樣，每次實驗的同時做出相應(yīng)的標準曲線。樣品根據(jù)標準曲線得到各樣品中2種細菌的數(shù)量，見表2和表3。

表2 富鍺木耳菌絲體對小鼠腸道大腸桿菌的影響（lgCFU/g，±s，n=10）Table 2 Effect of mycelium Ge enriched on the E.coli in intestines of mice（lgCFU/g，±s，n=10）

注：小寫字母不同表示差異顯著，p<0.05；大寫字母不同代表差異極顯著，p<0.01；表3同。

灌胃前 灌胃后正常喂養(yǎng)組 6.087±0.099a 6.226±0.138a 0.2mL/每只（富鍺菌絲體）組 6.126±0.200a 6.074±0.201a 0.2mL/每只（0.9%NaCl）組 6.130±0.193a 6.031±0.214a

表3 富鍺木耳菌絲體對小鼠腸道乳酸桿菌的影響（lgCFU/g，±s，n=10）Table 3 Effect of mycelium Ge enriched on the L.lactis in intestines of mice（lgCFU/g，±s，n=10）

灌胃前 灌胃后正常喂養(yǎng)組 7.750±0.098a 7.698±0.080B 0.2mL/每只（富鍺菌絲體）組 7.737±0.055a 8.246±0.189A 0.2mL/每只（0.9%NaCl）組 7.744±0.043a 7.681±0.129B

經(jīng)Duncan新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進行多重方差分析表明，灌胃前、后各實驗組之間的大腸桿菌數(shù)量無顯著差異，喂飼富鍺木耳菌絲體組小鼠腸道中大腸桿菌與未喂飼富鍺木耳菌絲體組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)目無明顯變化，大腸桿菌的生長繁殖沒有受到顯著的影響；而喂飼富鍺木耳菌絲體小鼠的腸道中的乳酸桿菌與未喂飼富鍺木耳菌絲體組小鼠腸道內(nèi)的乳酸桿菌的數(shù)目有顯著區(qū)別（p＜0.01），富鍺木耳菌絲體可以對小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌的生長繁殖起到一定的促進作用。

3 結(jié)論

富鍺木耳菌絲體對小鼠腸道中大腸桿菌的繁殖沒有顯著影響，對小鼠腸道中乳酸桿菌的繁殖有顯著的促進作用（p＜0.01）。本實驗表明，富鍺木耳對調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群平衡，促進有益菌繁殖具有顯著效果。

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