李 卓，晏日安，*，曾永青

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632；2.廣州市食品工業(yè)研究所，廣東廣州 510410）

L-抗壞血酸（VC）是一種常用的水溶性抗氧化劑，然而其親水性限制了其在疏水相體系中的應(yīng)用，尤其是在脂溶性食品方面的應(yīng)用，如抗油脂氧化等。當(dāng)L-抗壞血酸分子的羥基通過酯化接入疏水性的長鏈脂肪酸基團(tuán)后，其親油性增加，使之成為一種兼具抗氧化性和乳化性兩種性能的優(yōu)良食品添加劑。L-抗壞血酸脂肪酸酯高效、安全、無毒，易溶于醇、醚及油脂中，對(duì)高溫、光照、重金屬、酸堿條件均較抗壞血酸穩(wěn)定。部分種類的L-抗壞血酸脂肪酸酯已經(jīng)被用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗氧化劑[1]，如L-抗壞血酸棕櫚酸酯（L-AP）作為油脂類抗氧化劑已經(jīng)應(yīng)用在很多油脂及含油食品中。L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成有化學(xué)合成法和酶催化法。雖然前者的得率較高，但反應(yīng)條件劇烈，并要用到濃硫酸等腐蝕性催化劑[2]。后者是利用脂肪酶在有機(jī)介質(zhì)中催化酯合成反應(yīng)，該合成方法反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少[3]。因此，國內(nèi)外有很多對(duì)酶催化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的研究，但目前的研究主要集中在少數(shù)幾種L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成和性質(zhì)研究，如L-抗壞血酸棕櫚酸酯等[4-5]。本文研究了合成一種新型L-抗壞血酸脂肪酸酯-L-抗壞血酸癸酸酯（L-AD），并確定在超聲波場中酶法合成的最佳合成條件，所得產(chǎn)物L(fēng)-抗壞血酸癸酸酯在室溫下為白色有光澤的針狀晶體，具有一定的油溶性，且抗氧化性強(qiáng)。L-抗壞血酸癸酸酯的合成過程中，水溶性的L-抗壞血酸在溶液的溶解度小和底物在反應(yīng)過程中局部濃度不均勻是制約產(chǎn)率提高的因素。超聲波近年來已經(jīng)應(yīng)用在了許多化學(xué)合成領(lǐng)域，其產(chǎn)生的空化作用在化學(xué)合成方面有重要作用[6]。超聲波的高頻振動(dòng)不僅可以促進(jìn)底物L(fēng)-抗壞血酸的溶解，增大其濃度促進(jìn)酯化反應(yīng)平衡右移以提高產(chǎn)率[2，7]，并且可以使底物均勻分散在溶劑中，有效解決局部濃度不均勻的問題，提高底物與酶的有效碰撞次數(shù)，加速反應(yīng)的進(jìn)行。本工作研究了新型抗氧化劑L-抗壞血酸癸酸酯的酶法合成，通過超聲波場的作用來提高反應(yīng)速度、提高產(chǎn)率，確定了合成的最佳條件，并研究了L-抗壞血酸癸酸酯的分離純化方法，對(duì)產(chǎn)物的純度和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析鑒定，同時(shí)測試了固定化脂肪酶（Novozym?435）可以重復(fù)使用的次數(shù)。另外，從羥基自由基體系、DHHP自由基體系、還原力測試以及氧化誘導(dǎo)時(shí)間測定等方面對(duì)L-抗壞血酸癸酸酯抗氧化性進(jìn)行研究，為新型L-抗壞血酸脂肪酸酯衍生物的合成與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

L-抗壞血酸、鄰二氮菲 天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；癸酸 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；叔丁醇、無水硫酸鎂、變色硅膠、硫酸亞鐵、三氯化鐵、三氯乙酸 天津市福晨化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯、正己烷、4A分子篩 天津市富宇精細(xì)化工有限公司，以上材料均為分析純；二苯苦味肼基自由基（DHHP·） 美國SIGMA-ALDRICH公司；大豆油 中糧集團(tuán)有限公司；葵花籽油 金龍魚股份有限公司。

SB25-12DTDN型超聲波處理機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；RE-52 AAB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司；X-5型顯微熔點(diǎn)測定儀 北京泰克儀器有限公司；KDC-1044型低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司；DZF-6030A型真空干燥箱 上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司；2XZ型旋片式真空泵 上海儀器供銷公司；EQUINOX 55型紅外光譜儀 布魯克光譜儀器公司；4000Q Trap型質(zhì)譜儀 AB SCIEX公司；UV-1601型紫外可見分光光度儀 北京瑞利分析儀器有限公司；743型Rancimat氧化穩(wěn)定性測試儀 瑞士萬通中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-抗壞血酸癸酸酯的合成方法 150mL圓底燒瓶，在固定化脂肪酶（Novozym?435）用量為L-抗壞血酸質(zhì)量的20%，L-抗壞血酸初始濃度為0.2mmol/mL、底物癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比為3∶1、4A分子篩用量為每10mL溶劑1g、水浴恒溫55℃，超聲波功率密度為0.40W/cm2，反應(yīng)時(shí)間為4h的條件下時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)固液分離，分出酶、分子篩，所得濾液經(jīng)減壓蒸餾蒸出溶劑，得到粗產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后用乙酸乙酯溶解，再經(jīng)水洗、分液后用無水硫酸鎂干燥12h，抽濾得濾液經(jīng)減壓蒸餾得到的產(chǎn)物用甲苯重結(jié)晶兩次，正己烷洗滌，真空干燥5h，稱產(chǎn)物質(zhì)量并計(jì)算產(chǎn)率。

紅外光譜用布魯克光譜儀器公司EQUINOX 55型傅立葉變換紅外光譜儀測定，晶體直接測量，掃描范圍4000～500cm-1。

質(zhì)譜由美國AB SCIEX公司的4000Q Trap質(zhì)譜儀測定，采用電噴霧ESI離子源，電子能量70eV，傳輸線溫度275℃，離子源溫度200℃，采用負(fù)離子模式，母粒子m/z330，激活電壓1.5V，質(zhì)量掃描范圍0～1000。

1.2.2 L-抗壞血酸癸酸酯的純度測定 產(chǎn)物用顯微熔點(diǎn)儀測定產(chǎn)物熔程，測得產(chǎn)物熔程須在2℃以內(nèi)。并且用國標(biāo)GB16314-1996的碘量法方法測定產(chǎn)物的純度[8]。

1.2.3 L-抗壞血酸癸酸酯對(duì)羥自由基清除能力的測定 對(duì)羥基自由基清除能力的測定采用Fenton反應(yīng)[9]。先配制0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液，取該液1mL，加2mL的0.2mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4），充分混勻后加入0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，混勻后加入1mL不同濃度的L-抗壞血酸癸酸酯樣品為處理樣，對(duì)照樣加入1mL蒸餾水以補(bǔ)充體積；最后加入0.01%H2O21mL，空白對(duì)照不加0.01%H2O2，以蒸餾水補(bǔ)充體積。反應(yīng)液在37℃保溫1h后，于536nm處測定吸光度。同時(shí)與TBHQ、VC、AP比較清除能力。樣品對(duì)羥自由基的清除率按下式計(jì)算：

清除率（%）=（A536處理-A536對(duì)照）/（A536空白對(duì)照-A536對(duì)照）×100

1.2.4 L-抗壞血酸癸酸酯對(duì)DHHP自由基清除能力的測定 配制濃度為0.2mmol/L的DPPH·乙醇溶液，分別吸取不同濃度的L-抗壞血酸癸酸酯樣品的乙醇溶液2mL，加入0.2mmol/L的DPPH·乙醇溶液2mL，搖勻后在室溫黑暗處放置30min。以無水乙醇調(diào)零，測定517nm處的吸光值A(chǔ)樣品。再測定2mL DPPH溶液與2mL乙醇在517nm處的吸光值A(chǔ)DPPH·。同時(shí)與TBHQ、VC、AP比較清除能力[10]。樣品對(duì)DPPH·清除率按下式計(jì)算：清除率（%）=（ADPPH·-A樣品）/ADPPH·×100

1.2.5 L-抗壞血酸癸酸酯還原能力的測定 采用普魯士藍(lán)法[11]，并略作改進(jìn)。先將樣品配成一定質(zhì)量濃度溶液，取0.5mL L-抗壞血酸癸酸酯樣品溶液，加入到2.5mL 0.2mol/L的磷酸緩沖溶液（p H6.6）和2.5mL 1%的鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）的離心管中，混合均勻，50℃水浴20min后快速冷卻，加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，2000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，室溫下靜置反應(yīng)10min，于700nm處檢測吸光值。溶液在700nm處的吸光值越高，則樣品的還原能力越強(qiáng)。同時(shí)與TBHQ、VC、AP比較還原力。

1.2.6 L-抗壞血酸癸酸酯在油脂中的抗氧化性能的測定 通過測定各添加抗氧化劑的油樣氧化誘導(dǎo)期，比較抗氧化性[12]。精確稱取20mg各抗氧化樣品，用無水乙醇分出1.0mg/mL乙醇溶液，根據(jù)需要用移液管準(zhǔn)確移取一定量的抗氧化劑溶液分別加入到3.00g油樣中，配成相應(yīng)200ppm級(jí)的試樣，然后在Rancimat儀上測定各油樣的氧化誘導(dǎo)期，空氣流速為10mL/min，實(shí)驗(yàn)溫度為120℃。同時(shí)與TBHQ、VC、L-抗壞血酸棕櫚酸酯（AP）比較氧化誘導(dǎo)期。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有的數(shù)據(jù)都是進(jìn)行過三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，特定數(shù)據(jù)使用SPSS軟件程序進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，通過方差分析和多組樣本間差異顯著性分析。p＜0.05時(shí)，該組數(shù)據(jù)被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-抗壞血酸癸酸酯的合成及分離純化

2.1.1 溶劑對(duì)產(chǎn)率的影響 溶劑對(duì)脂肪酶催化合成的效率有很大影響，原因之一在于溶劑的極性是否合適。溶劑的極性會(huì)直接影響酶的活性和穩(wěn)定性，溶劑的極性過大會(huì)使酶的水化層逐漸被破壞，導(dǎo)致酶的失活。選擇合適的溶劑也需考慮反應(yīng)物和產(chǎn)物在溶劑中的溶解性，L-抗壞血酸分子具有一定極性，癸酸分子為非極性，因此要選擇一種具有合適極性的溶劑可以同時(shí)溶解L-抗壞血酸和癸酸，同時(shí)又不會(huì)造成酶的失活。且兼顧溶劑揮發(fā)性、沸點(diǎn)、成本、毒性等影響產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的因素。

圖1 溶劑對(duì)L-AD產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of solvent on yield of L-ascorbic decanoate

當(dāng)固定化脂肪酶（Novozym?435）用量為L-抗壞血酸質(zhì)量的20%，L-抗壞血酸初始濃度為0.2mmol/mL、底物癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比為3∶1、4A分子篩用量為每10mL溶劑1g、水浴恒溫55℃，超聲波功率密度為0.40W/cm2，反應(yīng)時(shí)間為4h時(shí)，分別使用正己烷、氯仿、叔戊醇、叔丁醇、四氫呋喃、丙酮、乙醇和甲醇作為溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，極性適中的叔戊醇、叔丁醇、四氫呋喃和丙酮都可以作為合成L-抗壞血酸癸酸酯的溶劑，叔戊醇與叔丁醇產(chǎn)率幾乎相同，但叔丁醇的沸點(diǎn)比叔戊醇低很多，因此，減壓蒸餾除去溶劑時(shí)相對(duì)容易且耗能較低，且叔丁醇市售價(jià)格較叔戊醇便宜很多，考慮產(chǎn)業(yè)化因素，選擇叔丁醇作為合成L-抗壞血酸癸酸酯的溶劑。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響 L-抗壞血酸在叔丁醇中的溶解度有限，隨著反應(yīng)進(jìn)行，L-抗壞血酸在溶劑中逐漸溶解，且酯化反應(yīng)需要一定的時(shí)間才達(dá)到平衡。當(dāng)條件為固定化脂肪酶（Novozym?435）用量為L-抗壞血酸質(zhì)量的20%，L-抗壞血酸初始濃度為0.2mmol/mL、底物癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比為3∶1、4A分子篩用量為每10mL溶劑1g、水浴恒溫55℃，超聲波功率密度為0.40W/cm2，反應(yīng)時(shí)間由1～6h時(shí)的產(chǎn)率變化如圖2所示。由圖2可知，反應(yīng)時(shí)間對(duì)于L-抗壞血酸癸酸酯的產(chǎn)率有很大影響，在4h內(nèi)隨著時(shí)間的延長，產(chǎn)率逐漸升高；超過4h后，產(chǎn)率提升緩慢并逐步趨于平穩(wěn)，反應(yīng)基本處于平衡狀態(tài)，再延長反應(yīng)時(shí)間并不能夠有效提高產(chǎn)率，因此，最佳反應(yīng)時(shí)間選為4h。

圖2 時(shí)間對(duì)L-AD產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction time on yield of L-ascorbic decanoate

2.1.3 溫度對(duì)產(chǎn)率的影響 固定化脂肪酶催化的酯化反應(yīng)需要在合適的溫度下才能進(jìn)行，其催化效率也與溫度密切相關(guān)。當(dāng)固定化脂肪酶（Novozym?435）用量為L-抗壞血酸質(zhì)量的20%，L-抗壞血酸初始濃度為0.2mmol/mL、底物癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比為3∶1、4A分子篩用量為每10mL溶劑1g、超聲波功率密度為0.40W/cm2，反應(yīng)時(shí)間為4h時(shí)，水浴溫度由40℃升至65℃時(shí)的產(chǎn)率變化如圖3所示。由圖3可知，在40～55℃時(shí)，升溫有利于酶促反應(yīng)速度的升高，使得酯化反應(yīng)的產(chǎn)率迅速提高，當(dāng)溫度為55℃時(shí)L-抗壞血酸癸酸酯產(chǎn)率達(dá)到最高。但當(dāng)溫度超過55℃時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，L-抗壞血酸癸酸酯產(chǎn)率卻有所下降。此外，產(chǎn)物的抗氧化基團(tuán)連烯二醇結(jié)構(gòu)在高溫下易被破壞，如果過高溫度也會(huì)降低產(chǎn)物的產(chǎn)率。因此，反應(yīng)的最佳溫度選為55℃。

圖3 溫度對(duì)L-AD產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of temperature on yield of L-ascorbic decanoate

2.1.4 脂肪酸與L-抗壞血酸摩爾比對(duì)產(chǎn)率的影響 底物的摩爾比對(duì)L-抗壞血酸癸酸酯產(chǎn)率有直接影響。固定化脂肪酶（Novozym?435）催化酯化反應(yīng)是L-抗壞血酸和癸酸反應(yīng)生成L-抗壞血酸癸酸酯和水的可逆反應(yīng)，為了使其中一種底物反應(yīng)轉(zhuǎn)化率提高，即平衡右移，可以使另一底物過量。在本反應(yīng)中，L-抗壞血酸在溶劑叔丁醇中溶解度較低，溶解于溶劑中的L-抗壞血酸不斷與癸酸反應(yīng)，同時(shí)未溶解的L-抗壞血酸不斷溶解補(bǔ)充，所以在反應(yīng)過程中其濃度基本無變化。因此，使在叔丁醇中的溶解度遠(yuǎn)大于L-抗壞血酸溶解度的癸酸過量，可以提高L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)條件為固定化脂肪酶（Novozym?435）0.35g，L-抗壞血酸10mmol，4A分子篩5g，叔丁醇50mL，水浴恒溫55℃，超聲波功率密度為0.40W/cm2，反應(yīng)時(shí)間為4h，癸酸物質(zhì)的量由10～50mmol時(shí)產(chǎn)率的變化如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比從1∶1上升至3∶1時(shí)，L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率明顯提高，繼續(xù)增大癸酸的濃度，L-抗壞血酸酯的產(chǎn)率不再繼續(xù)上升。因此，反應(yīng)的底物癸酸和L-抗壞血酸的最佳摩爾比選為3∶1。

圖4 底物的摩爾比對(duì)L-AD產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of substrate molar ratio on yield of L-ascorbic decanoate

2.1.5 超聲波功率密度對(duì)產(chǎn)率的影響 如上文所述，超聲波產(chǎn)生的作用會(huì)促進(jìn)L-抗壞血酸的溶解和促進(jìn)底物濃度均勻，進(jìn)而促進(jìn)L-抗壞血酸癸酸酯產(chǎn)率的提高和反應(yīng)時(shí)間的減少。當(dāng)固定化脂肪酶（Novozym?435）用量為L-抗壞血酸質(zhì)量的20%、L-抗壞血酸初始濃度為0.2mmol/mL、底物癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比為3∶1、4A分子篩用量為每10mL溶劑1g、水浴恒溫55℃，反應(yīng)時(shí)間為4h時(shí)，超聲波功率密度由0.00～0.40W/cm2時(shí)產(chǎn)率的變化如圖5所示。由圖5可知，酶催化效率受到底物擴(kuò)散速度的影響，局部濃度不均勻會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)率低，超聲波的功率密度影響了底物擴(kuò)散的速度。超聲波的工作頻率固定為40k Hz，當(dāng)功率密度小于0.16W/cm2時(shí)產(chǎn)率很低，當(dāng)超聲波的功率密度繼續(xù)提高時(shí)，產(chǎn)率明顯提高，當(dāng)達(dá)到處理機(jī)最大功率密度0.40W/cm2時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到78.48%。最佳功率密度定為0.40W/cm2。

圖5 超聲波的功率密度對(duì)L-AD產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power density on yield of L-ascorbic decanoate

2.1.6 固定化脂肪酶使用次數(shù)對(duì)產(chǎn)率的影響 工業(yè)化生產(chǎn)需要控制成本，本實(shí)驗(yàn)中酶的價(jià)格相對(duì)于其他原料較高，為了降低成本，固定化酶需要進(jìn)行重復(fù)使用，本實(shí)驗(yàn)考察了固定化酶在功率密度為0.40W/cm2、工作頻率為40k Hz時(shí)重復(fù)使用8次的效果。當(dāng)固定化脂肪酶（Novozym?435）用量為L-抗壞血酸質(zhì)量的20%、L-抗壞血酸初始濃度為0.2mmol/mL、底物癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比為3∶1、4A分子篩用量為每10mL溶劑1g、恒溫55℃，超聲波功率密度為0.40W/cm2，反應(yīng)時(shí)間為4h，使用次數(shù)與產(chǎn)率的關(guān)系如圖6所示。由圖6可知，前4批次產(chǎn)率都在60%以上，最高產(chǎn)率為首次使用時(shí)的產(chǎn)率78.48%，后4批次產(chǎn)率明顯降低到40%以下，可能是脂肪酶的在多批次合成之后出現(xiàn)了鈍化，也可能是固定化脂肪酶酶受到超聲波的空化作用太強(qiáng)烈使得一部分固定化酶的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變形甚至破碎、脫落。因此，固定化脂肪酶的合適使用次數(shù)為4次。

圖6 固定化酶的使用次數(shù)對(duì)L-AD產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of the immobilized lipase reused times on yield of L-ascorbic decanoate

2.2 產(chǎn)物的鑒定

2.2.1 產(chǎn)物的純度測定 由超聲波場中固定化脂肪酶催化合成處的粗產(chǎn)物，分離提純后得到的為白色有光澤的針狀晶體，測得熔點(diǎn)為94.1～94.9℃，用國標(biāo)GB16314-1996的碘量法[8]測定產(chǎn)物的純度為98.6%。

2.2.2 產(chǎn)物的紅外光譜檢測 從紅外光譜圖（圖7）中可以看出3390cm-1處出現(xiàn)-OH的吸收峰，在2919cm-1出現(xiàn)了CH2的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，在1730cm-1出現(xiàn)了羧酸酯基的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1654cm-1出現(xiàn)了L-抗壞血酸的C=C的吸收峰，指紋區(qū)的吸收峰（1290、1144、723cm-1）進(jìn)一步提供了證明，符合L-抗壞血酸癸酸酯的結(jié)構(gòu)特征。

圖7 L-抗壞血酸癸酸酯的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrogram of L-ascorbic decanoate

2.2.2 產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測 質(zhì)譜圖（圖8）中的分子離子峰329.6（M-1）和660.1（2M-1）也證實(shí)了所得產(chǎn)物為L-抗壞血酸癸酸酯。

2.3 L-抗壞血酸癸酸酯的抗氧化性測定

圖8 L-抗壞血酸癸酸酯的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectrogram of L-ascorbic decanoate

2.3.1 L-抗壞血酸癸酸酯對(duì)羥自由基清除能力的測定 采用鄰二氮菲Fe2+氧化法測定L-抗壞血酸癸酸酯對(duì)羥自由基的清除能力，原理是鄰二氮菲與Fe2+能夠生成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，此絡(luò)合物在510nm波長處有最大吸收，反應(yīng)體系中定量加入Fe+2和H2O2，通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，自由基和H2O2把一部分Fe2+氧化為Fe3+，使橙紅色絡(luò)合物減少，加入抗氧化劑可與體系中的自由基和氧化劑反應(yīng)，抑制Fe2+的減少，通過測定吸光度的變化以評(píng)價(jià)抗氧化劑清除羥基自由基能力的高低。

圖9 L-抗壞血酸癸酸酯對(duì)羥自由基的清除能力的測定Fig.9 Hydroxyl radical clearing capacity of L-ascorbic decanoate

由圖9可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各抗氧化劑對(duì)羥自由基的清除能力都隨著濃度的增加而增強(qiáng)，因?yàn)樵跇O性較強(qiáng)的溶劑中L-抗壞血酸溶解度大，且相同質(zhì)量濃度試樣中有抗氧化活性的連烯二醇結(jié)構(gòu)所占比重相對(duì)較高。此法測定結(jié)果為L-抗壞血酸的清除羥自由基的能力較強(qiáng)，L-抗壞血酸癸酸酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯次之，TBHQ最弱，且各抗氧化劑清除能力與其質(zhì)量濃度基本成量效關(guān)系。

2.3.2 L-抗壞血酸癸酸酯對(duì)DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基分析法被廣泛用于抗氧化性的測定。此法是根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517nm處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析。

由圖10可知，各試樣均對(duì)DPPH自由基有清除能力，清除率隨試樣濃度的增大而增強(qiáng)。在相同的質(zhì)量濃度下，TBHQ對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，抗壞血酸次之，L-抗壞血酸癸酸酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯較弱，可能因相同質(zhì)量試樣中有抗氧化活性的連烯二醇結(jié)構(gòu)所占比重相對(duì)較高所致。

圖10 L-抗壞血酸癸酸酯對(duì)DPPH·清除能力的測定Fig.10 DPPH radical clearing capacity of L-ascorbic decanoate

2.3.3 L-抗壞血酸癸酸酯的還原性測定 還原力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的指標(biāo)之一，可檢驗(yàn)化合物是否為良好的電子供體。抗氧化物質(zhì)提供的電子可以把Fe+3還原為Fe+2，引起體系溶液顏色的改變，測定吸光度就可以判斷物質(zhì)還原能力的強(qiáng)弱，還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。

圖11 L-抗壞血酸癸酸酯的還原性測定Fig.11 Reducing power of L-ascorbic decanoate

由圖11可知，各試樣都具有一定的還原力，各物質(zhì)的還原力隨著濃度的增加而增強(qiáng)?？赡芤騿挝毁|(zhì)量試樣中有抗氧化活性的連烯二醇結(jié)構(gòu)所占比重相對(duì)較高，在相同的質(zhì)量濃度下L-抗壞血酸癸酸酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯弱于L-抗壞血酸，但強(qiáng)于TBHQ。

2.3.4 L-抗壞血酸癸酸酯在油脂中的抗氧化性能的測定 通過將一定量的油脂在反應(yīng)器中加熱并通入空氣，促使油脂氧化產(chǎn)生氫過氧化物，氫過氧化物受熱分解，產(chǎn)生短碳鏈揮發(fā)性物質(zhì)如醇、醛、酸等，揮發(fā)性物質(zhì)被吸收瓶中的去離子水吸收。通過測定吸收液的導(dǎo)電變化，來反應(yīng)油脂的氧化穩(wěn)定性，其表示方法為氧化誘導(dǎo)時(shí)間（用h表示）。誘導(dǎo)時(shí)間越長，抗氧化性越好，反之越差。

圖12 L-抗壞血酸癸酸酯在油脂中的抗氧化性能測定Fig.12 Antioxidant activity in oils of L-ascorbic decanoate

由圖12可知，各試樣均對(duì)兩種油脂的氧化誘導(dǎo)時(shí)間有延長作用，即有抗氧化作用。添加相同抗氧化劑試樣的葵花籽油比大豆油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間短，符合規(guī)律：即不飽和脂肪酸越多，氧化速度越快。在兩種不同的油脂中，L-抗壞血酸癸酸酯的抗氧化能力稍強(qiáng)于L-抗壞血酸棕櫚酸酯，且兩者都強(qiáng)于TBHQ，L-抗壞血酸抗氧化性最弱。在相同質(zhì)量濃度下，L-抗壞血酸雖然在清除羥自由基、DPPH自由基能力和還原力強(qiáng)于另外三種抗氧化劑，但是，L-抗壞血酸不能很好溶于油脂中，抗氧化的基團(tuán)無法與油脂良好的接觸碰撞，導(dǎo)致抗氧化能力低。L-抗壞血酸癸酸酯克服了L-抗壞血酸油溶性不好的缺點(diǎn)，并且具有良好的抗氧化性；由于L-抗壞血酸癸酸酯分子的側(cè)鏈碳原子比L-抗壞血酸棕櫚酸酯分子的側(cè)鏈碳原子少了六個(gè)碳原子，所以相同質(zhì)量濃度中L-抗壞血酸癸酸酯的連烯二醇結(jié)構(gòu)的比重大于L-抗壞血酸棕櫚酸酯，可能導(dǎo)致L-抗壞血酸癸酸酯的抗氧化能力稍大于L-抗壞血酸棕櫚酸酯。

3 結(jié)論

超聲波可以顯著促進(jìn)L-抗壞血酸的溶解，加速固定化脂肪酶在叔丁醇中催化合成L-抗壞血酸癸酸酯，提高產(chǎn)率，縮短反應(yīng)平衡時(shí)間。同時(shí)適當(dāng)過量的癸酸，合適的溶劑、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及超聲波功率密度可以使產(chǎn)率達(dá)到最高，最佳的條件為：酶用量為L-抗壞血酸質(zhì)量的20%、L-抗壞血酸初始濃度為0.2mmol/mL、底物癸酸與L-抗壞血酸的摩爾比為3∶1、4A分子篩用量為每10mL溶劑1g、恒溫55℃，超聲波功率密度為0.40W/cm2，反應(yīng)時(shí)間為4h，最高產(chǎn)率達(dá)到78.48%。L-抗壞血酸癸酸酯具有很強(qiáng)的清除羥自由基、DPPH自由基能力和還原力，在一定質(zhì)量濃度下優(yōu)于L-抗壞血酸棕櫚酸酯，且前兩個(gè)指標(biāo)優(yōu)于TBHQ；并且克服了L-抗壞血酸油溶性不好的缺點(diǎn)，添加入油脂后的抗氧化作用明顯。因此，L-抗壞血酸癸酸酯是一種有潛力的抗氧化劑，有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

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