王 玲，尚云青，匡 鈺，張美欣

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.云南中醫(yī)學院，云南昆明650500；3.云南省德宏熱帶作物科學研究所，云南德宏 678600）

菠蘿（Ananas comosus）學名鳳梨，是著名的熱帶、亞熱帶特產水果之一，成熟時不僅色澤鮮艷，而且氣味芳香、味道清甜、深受廣大消費者的喜愛。分析測試結果表明：菠蘿鮮果中含水量達80%以上，還含有大量的還原糖，維生素A、B、C，磷和檸檬酸等，且糖酸比例合適[1]，非常適合于釀酒。由菠蘿汁釀成的菠蘿酒營養(yǎng)分豐富，是一種兼具營養(yǎng)與保健價值的低度果酒[2]。但目前菠蘿果酒的生產由于沒有專用的酵母菌，而大多采用市售的葡萄酒用活性干酵母進行發(fā)酵，產品缺乏菠蘿果實特有的香氣，風味欠佳。針對這些問題，本課題組之前對菠蘿果酒發(fā)酵專用菌種進行了篩選[3]，并在近期制作成了活性干酵母，本研究對自制的活性干酵母發(fā)酵菠蘿果酒的適宜條件進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿 八成熟，無刺卡因種，湛江鷹峰食品有限責任公司生產基地；菠蘿果酒活性干酵母 以自行篩選的優(yōu)良酵母菌為出發(fā)菌株，在一定的條件下對酵母菌進行培養(yǎng)，真空冷凍干燥制得的活性干酵母；檸檬酸、無水亞硫酸鈉 均為分析純；HR1861榨汁機 珠海飛利浦家用電器有限公司；SPX-250B恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；HZQ-F-160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析檢測方法 總酸（以檸檬酸計，g/100mL）酸堿滴定法[4]；酒度（v/v，20℃） 蒸餾法[5]；總糖（g/100mL）GB/T 15037-2006葡萄酒及果酒中總糖的測定[6]；二氧化硫（mg/L）GB/T 5009.34-2003食品中亞硫酸鹽的測定[7]；菌落總數(shù)測定（cfu/mL）GB/T 4789.2-2010食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定[8]；大腸菌群測定 大腸菌群MPN計數(shù)法，按GB/T 4789.2-2010執(zhí)行[9]。

1.2.2 菠蘿果酒生產工藝

1.2.3 操作要點 選取八成熟的無病蟲害且無霉爛變質的新鮮菠蘿果實，經預處理后榨汁，調節(jié)菠蘿汁的糖酸，向菠蘿汁中加入一定量的SO2抑制雜菌生長，取一定量的自制菠蘿酒用活性干酵母復水活化后，進行酒精發(fā)酵。

1.3 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的單因素實驗

菠蘿汁的發(fā)酵溫度、pH、初始糖度及接種量四因素是影響菠蘿果酒發(fā)酵質量的主要因素。分別設計在26、28、30、32、34℃的發(fā)酵溫度；pH為4、4.5、5、5.5、6；初始糖度為15、17、19、21、23°Brix；接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%的條件下發(fā)酵6d，以生成的酒精度為考核指標，對菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件進行單因素實驗。

1.4 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

在初始糖度、發(fā)酵溫度、pH、接種量單因素實驗的基礎上，采用二次回歸旋轉組合設計[10]來進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，二次回歸設計參數(shù)為p=4，mc=16，γ=2.000，m0=12，n=36，實驗的因素水平編碼表見表1。

2 結果與分析

2.1 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對菠蘿果酒發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度對果酒的發(fā)酵有很大影響，如果溫度過高，雖然可提高發(fā)酵速度，但容易使微生物細胞活性快速降低，發(fā)酵能力減弱；溫度太低，在發(fā)酵初期容易感染雜菌造成發(fā)酵失敗。由圖1可知，在26～34℃的選定的實驗點溫度范圍內，32℃條件下的發(fā)酵溫度比較理想。

2.1.2 pH對菠蘿果酒發(fā)酵的影響 pH對菠蘿果酒發(fā)酵的影響如圖2所示。隨著pH的增加，酵母菌酒精產率先增強后減弱，pH為5.5時達到最大。所以，菠蘿果酒發(fā)酵液的理想pH為5.5。

2.1.3 初始糖度對菠蘿果酒發(fā)酵的影響 初始糖度對菠蘿果酒發(fā)酵的影響如圖3所示。從圖3中可以看出，初始糖度在21°Brix之前，酒精度隨著初始糖度的增加而增高，但之后糖度增加，酒精生成量反而下降，這主要是因為糖含量太高，酵母細胞的滲透壓增大，對酵母菌細胞內酶的活性產生一定的影響，所以，21°Brix生成的酒精度比較理想。

2.1.4 接種量對菠蘿果酒發(fā)酵的影響 接種量直接影響菠蘿果酒發(fā)酵的酒精度，接種量太低，不但發(fā)酵速度變得緩慢，而且容易使發(fā)酵液在發(fā)酵初期感染雜菌，影響發(fā)酵進程；接種量太高，雖然發(fā)酵初期可提高發(fā)酵速度，但會造成酒液發(fā)酵后勁不足。由圖4可以看出，接種量為5%時，酒精生成量較高。

2.2 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)菠蘿果酒發(fā)酵的單因素實驗結果，按照表1的方法對菠蘿果酒發(fā)酵進行四因素二次回歸正交旋轉設計實驗以確定最優(yōu)工藝條件，結果如表2所示。

根據(jù)實驗結果，以發(fā)酵酒精度為響應值，運用SAS RSREG（response surface regression）程序[11]對36個實驗點響應值進行回歸分析，結果見表3、表4。

由表3、表4分析結果可以看出，因素X1（溫度），X2（pH）、X3（初始糖度）和X4（接種量）對酒精度呈極顯著（p＜0.01）影響，因素X1X2、X1X4、X2X3、X3X4對響應值的曲面效應也呈現(xiàn)極顯著影響，由此可以得出結論為：溫度、pH、初始糖度和接種量是菠蘿果酒發(fā)酵工藝中重要的影響因素，根據(jù)F值的大小，確定四個因素對發(fā)酵酒度的影響大小為：X3＞X2＞X1＞X4，即：初始糖度＞pH＞溫度＞接種量。

經SAS回歸擬合后，各實驗因子對響應值酒精度的影響可以通過回歸方程表示為：

Y=8.1+0.2972X1+0.2958X2+0.2625X3+0.1792X4-0.2823+0.2813X1X2+0.1188X2X3+0.1938X1X4+0.2063X3X4-0.28232-0.3037-0.1948-0.4948，模型可信度分析見表5。

綜合表3～表5可知，用回歸方程描述各實驗因子與響應值酒精度之間的關系時，其因變量酒精度與全體自變量包括溫度、pH、初始糖度、接種量之間的多元回歸關系顯著，復相關系數(shù)的平方（R2）為0.9573，表明該模型理論上可以反映響應值的95.73%。響應值的變異系數(shù)（C.V.%）為3.1086，方程模型F值為33.67，遠遠大于F0.01（14，15）=3.8的數(shù)值，總的回歸關系達到極顯著水平，表明實驗設計合理，回歸方程在選取的實驗點上與實驗結果擬合得較好。同時，方程失擬項的F值為1.99，p值為0.138（p＞0.05），失擬檢驗不顯著，表明回歸方程在整個回歸區(qū)域的擬合情況良好，即采用該模型是合理的，可以用該方程對不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵酒度進行預測。

模型優(yōu)化參數(shù)分析可得酒精度最大值所需要的參數(shù)條件為：溫度為33.68℃，pH5.609，初始糖度20.60%，接種量5.48%。在此最優(yōu)工藝下酒精度預測值為8.74%。

為進一步檢驗該預測模型的可靠性，采用該模型最優(yōu)化分析所得出的方案通過修整進行菠蘿果酒發(fā)酵實驗[12]，實際操作條件調整為：溫度33.7℃，pH5.6，初始糖度20.5%，接種量5.5%，重復3次實驗取平均值，實際測得的酒精度為8.7%±0.2%。在顯著性水平p＜0.05的前提下，預測值與實際值無顯著性差異。由此可得，采用二次回歸正交旋轉設計優(yōu)化得到的酒精發(fā)酵條件參數(shù)準確可靠，模型具有實用價值。

2.3 響應面分析

影響菠蘿果酒發(fā)酵的各實驗因素（溫度、pH、初始糖度和接種量）之間的交互作用與響應值（酒精度）之間的關系，如圖5～圖8所示。

2.3.1 溫度與pH的交互作用對發(fā)酵酒度的影響 由圖5可得，溫度與pH的交互作用對發(fā)酵酒度的影響顯著，曲面呈現(xiàn)良好的拱形，存在最大值。隨著發(fā)酵溫度和pH的增加，發(fā)酵酒度隨之增加，達到最高點后，又逐漸減小。當pH很低時，溫度對酒精度的影響較小，這是因為過高的酸度抑制了酵母菌的活性，影響其生長。

2.3.2 溫度與接種量的交互作用對發(fā)酵酒度的影響由圖6可以看出，溫度與接種量的交互作用對發(fā)酵酒度的影響顯著。當接種量一定時，隨著溫度升高，酵母細胞活性逐漸增強，酒精生成量不斷上升，但當溫度升到一定水平時，酵母菌菌體內的蛋白質和酶的抗熱性降低，酒精度就會逐漸下降，所以出現(xiàn)酒精度先升高后降低的現(xiàn)象，并且變化趨勢比較明顯。

2.3.3 pH與初始糖度的交互作用對發(fā)酵酒度的影響圖7可以看出，pH與初始糖度的交互作用對發(fā)酵酒度的影響顯著，曲面呈現(xiàn)良好的拱形，存在最大值。隨著pH與初始糖的增加，發(fā)酵酒度隨之增加，達到最高點后，又逐漸減小。

2.3.4 初始糖度與接種量對發(fā)酵酒度的影響 由圖8可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，初始糖度與接種量對發(fā)酵酒度的影響顯著，在接種量一定時，隨著初始糖度的增加，發(fā)酵酒度也隨之增加，達到最高點后，又逐漸減小。這是因為過高的初始糖度在發(fā)酵后期會造成較高的滲透壓而抑制酵母菌的活性，影響其生長。

2.4 菠蘿果酒品質檢驗

將自制菠蘿果酒活性干酵母按以上研究的最佳工藝條件對菠蘿果汁進行發(fā)酵，得到的菠蘿果酒與市售葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒進行比較，各項質量指標如表6所示。

由表6可以看出，自制菠蘿果酒活性干酵母與市售的葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵的菠蘿果酒酒度在色澤、組織狀態(tài)等方面沒有明顯的區(qū)別，都呈清亮透明的金黃色，但自制活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒比市售的葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒在風味方面有一定優(yōu)勢，菠蘿果香濃郁，風味較好，酒精度也較高，達到8.7%，比市售葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒高0.9%。

3 結論

將自制菠蘿果酒活性干酵母進行復水活化后應用到菠蘿果汁的發(fā)酵中，用單因素實驗結合響應面法優(yōu)化其工藝條件。菠蘿果酒發(fā)酵過程的模型為：Y=8.1+0.2972X1+0.2958X2+0.2625X3+0.1792X4-0.2823X12+0.2813X1X2+0.1188X2X3+0.1938X1X4+0.2063X3X4-0.2823X12-0.3037X22-0.1948X42-0.4948X32；優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵工藝條件為：溫度33.7℃、pH5.6、初始糖度20.5%、接種量5.5%，在此條件下發(fā)酵的菠蘿果酒的酒度比葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒高，達到8.7%，而且菠蘿果香濃郁，風味較好。

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[6]中華人民共和國衛(wèi)生部中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.7-2003食品中總糖的測定[S].北京：中國標準出版社，2003.

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[8]中華人民共和國衛(wèi)生部中國國家標準化管理委員會.GB/T 4789.2-2010食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

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