呂 瑩，楊柏崇，王 瑩，陳 怡，陳文茜，韓 濤

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.譜尼測試科技股份有限公司食品實(shí)驗(yàn)室，北京100080）

核桃富含不飽和脂肪酸、核桃蛋白和內(nèi)皮多酚等成分，對健康調(diào)節(jié)起著重要作用，目前核桃的深加工產(chǎn)品主要有核桃油、核桃乳和核桃粉等。核桃粕是核桃榨油后的副產(chǎn)物，約含有30%～50%的蛋白質(zhì)[1－2]。核桃蛋白主要由四類蛋白質(zhì)構(gòu)成：白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，分別占核桃蛋白總量的6.81%、17.57%、5.33%和70.11%[3]。大量研究表明，核桃蛋白的體外酶解物：核桃肽具有抗氧化活性[1－2，4]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，對原料進(jìn)行預(yù)處理，如加熱或采用物理場，可以破壞蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使其易于被酶解、提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率，或增強(qiáng)酶解物的功能性。加熱、微波和超聲波處理是目前常用的蛋白質(zhì)變性的方法。對經(jīng)過超聲波預(yù)處理的燕麥蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物燕麥肽的ACE抑制活性顯著增加[5]；而采用微波輔助水解法制備絲素肽能大大降低能耗，節(jié)省成本[6]。目前有關(guān)核桃肽的抗氧化活性研究多集中在酶解條件的優(yōu)化上[1，7－8]，不同的預(yù)處理方法對核桃肽抗氧化活性的影響未見報(bào)道。因此，本研究考察了直接酶解、堿提、加熱、微波、超聲波預(yù)處理高溫和低溫脫脂核桃粕對核桃肽抗氧化活性和得率的影響，以及由兩種核桃粕提取核桃蛋白后進(jìn)行酶解得到核桃肽抗氧化活性的差異，為核桃蛋白的應(yīng)用提供基礎(chǔ)，也為核桃深加工技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

低溫脫脂核桃粕（液壓冷榨法制油）河北省石家莊京丸有限公司；高溫脫脂核桃粕（螺桿擠壓法高溫榨油） 北京綠湖工貿(mào)公司惠贈；中性蛋白酶和堿性蛋白酶 諾維信公司惠贈；風(fēng)味蛋白酶、酸性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶 日本天田野酶制劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

Wave－1000型微波紫外超聲波合成萃取反應(yīng)儀上海新儀微波化學(xué)科學(xué)科技有限公司；PP－25型pH計(jì) 德國賽多利斯；FD－1C－50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LXJ－ⅡB型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV－1800型紫外－可見分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 低溫和高溫脫脂核桃粕中提取核桃蛋白

脫脂核桃粕粉碎，按料液比1∶15（w∶v）加水，用5.0mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8.0～9.0，50℃浸提1h。離心（4000r/min，20min），去除沉淀。上清液加5.0mol/L HCl調(diào)pH至5.0，靜置30min，離心（4000r/min，20min），沉淀用蒸餾水洗兩遍。加入5.0mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH7.0，得上清液，冷凍干燥即為核桃蛋白[4]。

1.3 核桃粕的預(yù)處理

1.3.1 超聲波預(yù)處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，超聲波處理15min，溫度為室溫，功率300W。

1.3.2 微波預(yù)處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，微波處理3min，溫度為75℃，功率300W。

1.3.3 水浴加熱預(yù)處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，水?。?0～95℃）條件下加熱10min。

1.3.4 堿提預(yù)處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，采用0.5mol/L NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)至7.5，溶解1h。

1.3.5 50℃堿提預(yù)處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，采用0.5mol/L NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)至7.5，50℃溶解1h。

1.4 核桃肽的制備

1.4.1 由核桃蛋白制備核桃肽 核桃蛋白（2%）用5.0mol/L HCl和5.0mol/L NaOH調(diào)到酶解最適pH→加入各種蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶）→在酶最適作用溫度下水解4h→得到酶解液→離心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷凍干燥得到核桃肽（每種酶的酶解條件見表1）。

1.4.2 由核桃粕直接酶解制備核桃肽 4g高溫或低溫脫脂核桃粕→加入100mL蒸餾水?dāng)嚢杵鲾嚢枞芙狻?.0mol/L HCl或5.0mol/L NaOH調(diào)到中性蛋白酶酶解最適pH→在酶最適作用溫度下水解4h→得到酶解液→離心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷凍干燥得到核桃肽。

1.4.3 由經(jīng)過預(yù)處理的核桃粕酶解制備核桃肽 經(jīng)過預(yù)處理的核桃粕（4%，w/v）→用5.0mol/L HCl或5.0mol/L NaOH調(diào)到中性蛋白酶酶解最適pH→在酶最適作用溫度下水解4h→得到酶解液→離心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷凍干燥得到核桃肽。

核桃肽得率以核桃肽凍干粉的重量與酶解前核桃蛋白或核桃粕重量之比來表示。

1.5 核桃肽抗氧化活性的測定

核桃肽的抗氧化活性以核桃肽的總還原能力表示。核桃肽配制成1mg/mL溶液，取樣品液2mL，加入2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液，再加入2mL、1%的鐵氰化鉀溶液充分混合?；旌衔镉?0℃加熱20min后加入2mL TCA（10%），充分混合后離心（4000r/min，10min）。取上清液2mL加入2mL蒸餾水和0.4mL、0.1%的FeCl3，三者充分混合。反應(yīng)10min后，于700nm下測定混合液吸光值。以蒸餾水作對照，核桃肽的還原能力以（樣品的吸光值—對照的吸光值）表示，吸光值越高，表示其還原能力越強(qiáng)[9]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以方差分析ANOVA來檢測平均值之間的差異，以p＜0.05為差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析使用OriginPro 7.5軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 五種酶酶解核桃蛋白

實(shí)驗(yàn)采用總還原能力方法評價(jià)酶解得到核桃肽的抗氧化活性，結(jié)果如表2所示。其中，中性蛋白酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的總還原能力最強(qiáng)，顯著高于其他四種酶（p＜0.05）；復(fù)合蛋白酶酶解得到核桃肽的抗氧化活性也較高（1.02±0.01）；而風(fēng)味和酸性蛋白酶酶解得到核桃肽的抗氧化活性最低。本研究中由工業(yè)用酸性蛋白酶M得到核桃肽的抗氧化活性較低，這一研究結(jié)果與用胃蛋白酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的研究結(jié)果一致[1]，不同的是本研究中是采用總還原力評價(jià)肽段的抗氧化活性，而后者采用的是DPPH法。另外，從各蛋白酶酶解核桃肽的得率可以看出中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解得到核桃肽的得率也較高，分別為89.00%和87.00%（見表2）。因此，根據(jù)不同酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的抗氧化活性和得率的結(jié)果，選擇中性蛋白酶作為酶制劑進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，考察不同的預(yù)處理方式對以低溫或高溫脫脂核桃粕為原料制備核桃肽的得率和抗氧化活性影響。

2.2 不同預(yù)處理方式對低溫脫脂核桃粕酶解所得核桃肽的抗氧化活性和得率的影響

低溫脫脂核桃粕為核桃榨油過程中采用冷壓榨工藝得到的副產(chǎn)物，其中的蛋白質(zhì)仍為未變性狀態(tài)。采用水浴加熱、超聲波、微波和堿提等預(yù)處理，考察核桃蛋白變性后酶解得到核桃肽的抗氧化活性的差異，結(jié)果如圖1所示。從低溫核桃粕中提取核桃蛋白并酶解得到核桃肽的抗氧化活性顯著高于其他以核桃粕為原料制備的核桃肽（p＜0.05）；而經(jīng)過堿提、微波預(yù)處理的核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性要顯著高于直接酶解、加熱和超聲波預(yù)處理的核桃肽（p＜0.05）?？梢?，與直接酶解核桃粕相比，本研究選用的堿提和微波預(yù)處理可以提高核桃肽的抗氧化活性。

表3為經(jīng)過不同預(yù)處理得到核桃肽的得率，對經(jīng)過預(yù)處理的核桃粕進(jìn)行酶解，核桃肽得率均高于直接酶解核桃粕的得率。預(yù)處理破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，進(jìn)而提高酶解效率，得率明顯增加。

核桃蛋白中谷蛋白為主要成分[3]。谷蛋白的特性為易溶于稀酸或稀堿，因此，在所有的預(yù)處理中，經(jīng)過堿提的預(yù)處理操作能提高核桃粕中核桃蛋白的溶解性，使其更易于與溶液的酶分子相互作用，酶解得到的核桃肽無論是抗氧化活性還是得率均較高。從微波和超聲波預(yù)處理核桃粕的效果來看，微波加熱對核桃粕的影響較為明顯，抗氧化活性和得率與直接酶解核桃粕相比，明顯增加（見圖1和表3）。目前有關(guān)微波與蛋白質(zhì)的酶解研究多集中在酶解過程中采用微波輔助加熱以縮短酶解時(shí)間和能耗上。本研究表明，采用微波對低溫核桃粕進(jìn)行預(yù)處理（300W、75℃、3min）可以顯著提高核桃肽的得率和抗氧化活性。已報(bào)道的有關(guān)采用超聲波對蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理的研究中，對燕麥麩皮進(jìn)行超聲波處理（190W、55℃、28min）顯著提高了燕麥肽的ACE抑制活性[10]；而對燕麥蛋白進(jìn)行超聲波預(yù)處理（50W、20min）時(shí)燕麥肽的ACE抑制活性提高，但水解度變化并不明顯[5]。本研究采用的超聲波處理?xiàng)l件是300W、15min、室溫，在該條件下對低溫核桃粕進(jìn)行預(yù)處理，核桃肽的得率和抗氧化活性與直接酶解相比雖有所增加，但效果不如其他的預(yù)處理方式。

另外，由低溫核桃粕提取核桃蛋白的提取率為15%～16%，核桃蛋白進(jìn)行酶解，核桃肽的得率為89%。但由核桃粕提取核桃蛋白須經(jīng)堿溶、酸沉、離心等工藝。而由核桃粕經(jīng)過各種預(yù)處理酶解得到核桃肽的得率為25.75%～47.3%?？梢?，工業(yè)生產(chǎn)中，與提取核桃蛋白需要的設(shè)備和條件相比，直接以經(jīng)過適當(dāng)預(yù)處理的核桃粕為原料制備核桃肽更符合低成本的需求。

2.3 不同預(yù)處理方式對高溫脫脂核桃粕酶解核桃肽的抗氧化活性和得率的影響

不同預(yù)處理方式對高溫脫脂核桃粕酶解核桃肽的抗氧化活性影響如圖2所示，核桃粕直接酶解得到核桃肽的抗氧化活性雖然高于堿提和核桃蛋白酶解得到的核桃肽，但相互之間的差異并無顯著性。而超聲波預(yù)處理后酶解得到核桃肽的抗氧化活性略低于50℃堿提和微波處理得到的核桃肽，但同樣的并不存在顯著性差異。表3所示的高溫核桃粕經(jīng)過不同的預(yù)處理，核桃肽的得率也相差不多。另外，由高溫核桃粕提取核桃蛋白后再進(jìn)行酶解得到的核桃肽的得率為82.9%，而圖2的結(jié)果顯示，直接酶解核桃粕和提取核桃蛋白后酶解得到核桃肽的抗氧化活性相差不多。因此，雖然由核桃蛋白酶解核桃肽的得率提高，但提取核桃蛋白的工藝過于繁瑣，且高溫核桃粕提取核桃蛋白的得率低（0.63%）。為降低成本，可以直接以高溫核桃粕為原料生產(chǎn)核桃肽。

高溫核桃粕為核桃通過螺旋壓榨的工藝制得，壓榨過程中溫度過高，核桃蛋白變性，使預(yù)處理對高溫核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率的影響不明顯。另外，高溫核桃粕的顏色為深褐色，酶解出來的核桃肽與低溫核桃粕酶解得到的核桃肽相比顏色較深。

3 結(jié)論

本文通過研究發(fā)現(xiàn)，對低溫脫脂核桃粕進(jìn)行預(yù)處理可以提高其酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率，其中堿提和微波預(yù)處理的效果明顯。但由于提取核桃蛋白的工藝過于繁瑣，工廠生產(chǎn)中為降低成本，可以對核桃粕進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理后直接酶解。而高溫脫脂核桃粕進(jìn)行堿提等預(yù)處理與直接酶解得到核桃肽的抗氧化活性無明顯差異。本文通過研究不同預(yù)處理方式對低溫和高溫脫脂核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率的影響，為核桃的深加工提供基礎(chǔ)。

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