李同剛，洪鵬志，楊 萍，趙 陽(yáng)

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

羅非魚是當(dāng)前淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要養(yǎng)殖品種之一。我國(guó)是世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖國(guó)及出口國(guó)，2009年產(chǎn)量已達(dá)120萬(wàn)t，約占當(dāng)年世界總產(chǎn)量的一半。羅非魚凍魚片加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生總質(zhì)量40%以上的下腳料[1-3]。羅非魚下腳料蛋白酶解液含有豐富的氨基酸、小肽、微量元素等多種小分子營(yíng)養(yǎng)成分，具有生物利用率高等優(yōu)點(diǎn)。鋅是人體必需微量元素，參與體內(nèi)200多種酶的組成，是細(xì)胞內(nèi)最豐富的微量元素。根據(jù)報(bào)道，鋅是中國(guó)人缺乏的營(yíng)養(yǎng)素之一，尤其是兒童、青少年缺鋅比較嚴(yán)重，嚴(yán)重的已經(jīng)影響智力和身高的正常發(fā)育。目前關(guān)于酶解物螯合金屬元素的研究很多，如趙洪雷等[4]制備了低質(zhì)魚小肽螯合鋅；楊珊珊等[5]研究了羅非魚皮多肽制備鋅螯合鹽；鐘明杰[6]用帶魚下腳料蛋白水解原料得到了鈣、鐵螯合物；汪學(xué)榮[7]使用豬血多肽制備鐵螯合鹽等。本實(shí)驗(yàn)利用復(fù)合酶酶解羅非魚下腳料，對(duì)酶解液與鋅的螯合工藝進(jìn)行優(yōu)化，探討螯合的最佳工藝條件，旨在為羅非魚下腳料的綜合加工利用提供新途徑，并希望為人體補(bǔ)鋅提供安全、綠色原料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚下腳料 由廣東恒興水產(chǎn)公司提供，羅非魚下腳料（包括頭、魚骨排、內(nèi)臟）去內(nèi)臟，洗凈，于絞肉機(jī)中絞碎后-18℃凍藏備用；中性蛋白酶（2.0×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（1.5×104U/g）均購(gòu)于南寧龐博生物工程有限公司；EDTA、硫酸鋅 均為分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；二甲基橙 分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司。

PHS-3C酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Mini pellicon超濾機(jī) 美國(guó)Thermo公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；EMS-4B磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解液的制備 取羅非魚下腳料一定量置于燒杯中，按固液比1∶4加水，于55℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱，按總加酶量1500U/g、中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合比1∶2加酶，pH不調(diào)，酶解30min。然后沸水滅酶15min，4500r/min離心15min得到上清液。將上清液通過(guò)0.45μm膜微濾，再過(guò)10ku超濾膜得到小于10ku的酶解液。

1.2.2 α-氨基態(tài)氮的測(cè)定 甲醛滴定法[8]。

1.2.3 螯合工藝

1.2.3.1 配位比對(duì)螯合率的影響 酶解液與硫酸鋅在配位比（α-氨基態(tài)氮與鋅離子的摩爾比[9]）設(shè)為1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1。

1.2.3.2 溫度對(duì)螯合率的影響 螯合溫度設(shè)為40、50、60、70、80℃。

1.2.3.3 時(shí)間對(duì)螯合率的影響 時(shí)間設(shè)為10、15、20、25、30min。

1.2.3.4 pH對(duì)螯合率的影響 螯合pH設(shè)為5、6、7、8、9。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)。螯合工藝流程：酶解液→測(cè)α-氨基態(tài)氮→按比例加Zn2+→攪拌→振蕩合成→離心分離→真空濃縮→乙醇洗滌→測(cè)螯合率。

1.2.4 螯合率的測(cè)定 EDTA絡(luò)合滴定法[10]。

式中：C-EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V1-滴定螯合態(tài)微量元素所消耗的EDTA溶液體積，mL；V0-滴定微量元素的總量所消耗的EDTA溶液體積，mL。

1.2.5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定因素編碼水平范圍，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，以螯合率為指標(biāo)，取配位比、溫度、時(shí)間、pH作為考察因素，共進(jìn)行31次實(shí)驗(yàn)，因素編碼見表1。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理 本實(shí)驗(yàn)均做了三次平行，結(jié)果為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液與硫酸鋅螯合的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 配位比對(duì)螯合率的影響 配位比是影響螯合率的一個(gè)重要因素，因?yàn)榕湮槐冗^(guò)小不能形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5]，導(dǎo)致螯合率較低；反之過(guò)大，螯合物雖穩(wěn)定但是螯合率也在下降，造成原料的浪費(fèi)，經(jīng)濟(jì)上也不合理。由圖1可知，在溫度60℃，時(shí)間15min，pH6.5時(shí)，配位比對(duì)螯合率的影響呈波動(dòng)變化，配位比在2.5∶1時(shí)螯合率達(dá)到最大值。

2.1.2 溫度對(duì)螯合率的影響 由圖2可知，在配位比2.5∶1，時(shí)間15min，pH6.5條件下，隨著溫度的升高螯合率也升高，當(dāng)溫度在60～70℃時(shí)螯合率最高，再升高溫度螯合率下降。這是由于螯合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)[11]，溫度高有利于螯合反應(yīng)，但溫度過(guò)高酶解液里的肽及其螯合物的結(jié)構(gòu)易被破壞；溫度過(guò)低，反應(yīng)速率慢，螯合率不高。

2.1.3 時(shí)間對(duì)螯合率的影響 由圖3可知，在配位比2.5∶1，溫度60℃，pH6.5條件下，時(shí)間在15min時(shí)螯合效果最佳，10min時(shí)螯合反應(yīng)不完全，所以螯合率不高；15min之后隨著超濾酶解液中肽或氨基酸濃度的降低，螯合率也在下降。

2.1.4 pH對(duì)螯合率的影響 由圖4可知，在配位比2.5∶1，溫度60℃，時(shí)間15min條件下，pH對(duì)螯合率影響很大，隨著pH升高螯合率先升后降，pH=7時(shí)效果最佳，當(dāng)pH在5、6時(shí)螯合率緩慢上升，當(dāng)pH＞7以后螯合率下降很快。原因可能是當(dāng)溶液中H+大量存在時(shí)，H+會(huì)與鋅離子爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)，不利于螯合物的生成；另外，在堿性條件下，羥基爭(zhēng)奪鋅離子而優(yōu)先生成氫氧化鋅沉淀而影響螯合物的形成[12]。

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化酶解液與硫酸鋅的最佳螯合條件

2.2.1 經(jīng)驗(yàn)數(shù)學(xué)模型 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)表1因素水平編碼表進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Design Expert軟件處理，得到回歸方程：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+0.30437X1X3+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.717282。

2.2.2 二次回歸模型的顯著性檢驗(yàn) 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析如表3所示。

為檢驗(yàn)回歸方程的有效性，按F1=失擬均方/誤差均方，F(xiàn)2=回歸均方/剩余均方的程序進(jìn)行檢驗(yàn)。由表3可知，在0.01水平上失擬項(xiàng)F1不顯著、F2極顯著，這表明方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的配合是可行的，可以用來(lái)建立模型。

根據(jù)表3，剔除α=0.10顯著水平不顯著項(xiàng)后，簡(jiǎn)化后的回歸方程為：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.71728。

該模型的R2=0.95588，R2adj=0.91727，說(shuō)明回歸方程對(duì)實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合情況較好。

2.2.3 模型驗(yàn)證 為驗(yàn)證模型的適用性，選取4組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果見表4。

由表4可知，4組的螯合率測(cè)定結(jié)果與根據(jù)模型計(jì)算得到的結(jié)果誤差均小于5%，說(shuō)明該模型能較好地反映螯合過(guò)程螯合率的變化情況。

2.2.4 各因素的重要性分析 在表3里，因?yàn)閄1、X2、X3、X4的均方分別為28.71094、12.48484、5.38654、18.42754，所以影響螯合率的四因素主次順序?yàn)椋号湮槐龋緋H＞溫度＞時(shí)間。

2.2.5 最佳螯合條件的確定 采用Design Expert軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到螯合的最佳條件為：配位比0.39水平（2.70∶1），溫度0.25水平（71.25℃），時(shí)間0.22水平（15.44min），pH為-0.29水平（6.86），理想螯合率可達(dá)88.08%?？紤]到實(shí)驗(yàn)室允許的條件以及實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中的必要性和可操作性，對(duì)優(yōu)化的工藝參數(shù)進(jìn)行了合理選擇，即配位比2.70∶1、溫度71.3℃、時(shí)間15min、pH6.86，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此時(shí)螯合率可達(dá)87.56%，與理論值相差1%之內(nèi)。在相關(guān)研究中，低質(zhì)魚蛋白多肽在理想條件下與鐵的螯合率為94.15%[5]；帶魚下腳料蛋白水解液在最佳條件下與鈣螯合，螯合率達(dá)79.75%[6]，大部分植物蛋白螯合率不高。相比之下，本實(shí)驗(yàn)得到的螯合條件較合理。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方法，確定了羅非魚下腳料酶解液螯合鋅的最佳螯合工藝條件為：配位比2.70∶1、溫度71.3℃、時(shí)間15min、pH6.86，螯合率達(dá)到87.56%，其中，各個(gè)因素對(duì)螯合率影響大小的順序是：配位比＞pH＞溫度＞時(shí)間。

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