范 悅，商亞珍

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元以外的另一大類細胞，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞有星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，其中星形膠質(zhì)細胞數(shù)量最多，幾乎囊括了所有膠質(zhì)細胞的功能。星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的相互作用，以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對神經(jīng)元的生存、正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理發(fā)育及病理過程都具有重要作用[1-2]。本研究探討了如何建立實驗室內(nèi)可行的獲得高純度星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)方法，以期為星形膠質(zhì)細胞的生物學(xué)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM-F12培養(yǎng)基，美國GIBCO公司;胎牛血清，奧地利PAA公司;胰蛋白酶，華美生物工程有限公司;纖維酸性蛋白(GFAP)一抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;羊抗兔二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng) 新生1-3d的SD大鼠，雌雄不限。剪開皮膚和顱骨，取兩塊皮質(zhì)，預(yù)冷PBS漂洗1-2次后，仔細剝除腦膜和血管。剪碎，加入0.125%胰蛋白酶置于37℃培養(yǎng)箱中消化30min,消化完全后加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。3500r/min離心5min，棄上清，計數(shù)，以2×105個/ml的密度接種于用0.1%多聚賴氨酸鋪底的培養(yǎng)瓶中。30min后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的細胞懸液，重新接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，差速貼壁以除去成纖維細胞。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3d換液一次。

1.3 星形膠質(zhì)細胞傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)至10-12d，待細胞80-90%融合時傳代。加入適量0.1%胰蛋白酶(以剛剛覆蓋細胞層為宜)后立即于倒置顯微鏡下觀察，待大部分細胞突起縮回、變圓時，立即吸出培養(yǎng)液，加入少量含10%胎牛血清的培養(yǎng)液直接吹打，待細胞層脫落。計數(shù)，以密度2×105個/ml接種于0.1%多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，當7-8d細胞80-90%融合時，再次傳代。

1.4 星形膠質(zhì)細胞的鑒定 培養(yǎng)第3代的細胞以5×104個/孔的密度接種于24孔板內(nèi)事先用0.1%多聚賴氨酸包被的圓形蓋玻片上，培養(yǎng)48h后進行免疫組化染色。吸去24孔板中的細胞培養(yǎng)液，加入PBS漂洗2-3次，加入4%多聚甲醛固定細胞30min后行免疫組化染色，一抗稀釋度1:100，陰性對照用PBS代替一抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，GFAP陽性產(chǎn)物位于細胞漿。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)結(jié)果 剛接種的細胞為圓形，胞體較小，3-6h貼壁。3-4d可見細胞基本呈圓形，長出細小突起。5-7d細胞突起變長，呈梭形、多邊形等形狀。隨培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量增多，胞體變大，逐漸交織成網(wǎng)狀。傳代后細胞生長明顯加快，3-4h貼壁，2-3d呈多種形態(tài)，6-7d細胞80-90%融合。在培養(yǎng)過程中可偶見神經(jīng)元，但隨培養(yǎng)時間的延長和傳代逐漸消失。

2.2 免疫組化結(jié)果 GFAP陽性產(chǎn)物位于細胞漿，呈棕黃色顆粒狀。細胞分兩層，上層為纖維性星形膠質(zhì)細胞，胞核小，突起長而細;下層為原漿性星形膠質(zhì)細胞，胞核大，橢圓，形狀不規(guī)則。隨機選取若干視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，顯示細胞純度95%以上。

3 討論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要間質(zhì)細胞，構(gòu)成神經(jīng)組織網(wǎng)架，具有分裂能力，可分泌和釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，能促進神經(jīng)元生長，形成神經(jīng)元微環(huán)境，具有神經(jīng)營養(yǎng)功能[3]。

體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞，并非來自已經(jīng)完全分化的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，而是它們的前體細胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中經(jīng)發(fā)育、分化，最終成為成熟的膠質(zhì)細胞。因此，取材時間最好在出生后的早期，此時前體細胞的數(shù)量接近峰值[4]。另外，使用新生1-3d大鼠的原因是出生后神經(jīng)元不再分裂，可盡量減少神經(jīng)元的污染，且神經(jīng)元不能傳代，經(jīng)過數(shù)次傳代即可去除神經(jīng)元。而星形膠質(zhì)細胞大量增殖發(fā)生在胚胎晚期和出生后，生長旺盛[5]。而且1-3d新生大鼠腦膜和血管較好剝離，盡量剝除腦膜和血管可以減少成纖維細胞的污染[6]。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的為混合星形膠質(zhì)細胞，細胞分為上下兩層，纖維性星形膠質(zhì)細胞和原漿性星形膠質(zhì)細胞都屬于星形膠質(zhì)細胞，可根據(jù)實驗需求不同，將兩種細胞分開培養(yǎng)[7]。原漿性星形膠質(zhì)細胞多分布于腦和脊髓的灰質(zhì)，含膠原纖維少，細胞體較大，突起寬而扁，分支少;纖維性星形膠質(zhì)細胞多分布于腦和脊髓的白質(zhì)，細胞內(nèi)富含膠原纖維，突起細長，分支多[8]。

星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞中數(shù)量最多的一種除了以往認識的在神經(jīng)系統(tǒng)中有營養(yǎng)支持作用外，與神經(jīng)元之間還存在復(fù)雜的相互作用，也與許多神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，尤其是神經(jīng)炎癥反應(yīng)，由星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞釋放的細胞因子介導(dǎo)。膠質(zhì)細胞的異常改變直接影響神經(jīng)功能的正常發(fā)揮[9-10]。因此，建立星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)的方法有利于探討星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)退行性疾病中的角色，以及研究藥物的作用及機制。

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