甄 珍，郭 英，邊育紅，張艷軍（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

·現(xiàn)代醫(yī)學(xué)·

胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用研究

甄 珍，郭 英，邊育紅，張艷軍*（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

胚胎干細(xì)胞（ES）是來源于早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團（ICM）或原始生殖細(xì)胞（PGC）的一種多能細(xì)胞，具有體外無限復(fù)制和高度分化潛能的特性。目前，胚胎干細(xì)胞已逐漸應(yīng)用在胚胎干細(xì)胞體外測試（EST）與新藥開發(fā)，移植治療與細(xì)胞替代治療，轉(zhuǎn)基因動物與克隆上，并已取得了一定的研究成果。

胚胎干細(xì)胞；生物學(xué)特性；EST；新藥開發(fā)；移植治療；細(xì)胞替代

胚胎干細(xì)胞（ES）是來源于早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團（ICM）或原始生殖細(xì)胞（PGC）的一種多能細(xì)胞。具有無限自我增殖的能力，即體外培養(yǎng)時ES細(xì)胞可以在一定的條件下保持不分化狀態(tài)且無限的自我復(fù)制。ES細(xì)胞還是一種全能干細(xì)胞，在特定條件下可向3個胚層的組織和細(xì)胞分化［1］。通常改變抑制ES細(xì)胞不分化狀態(tài)的培養(yǎng)條件，ES細(xì)胞就可以分化成多種細(xì)胞類型。ES細(xì)胞具有的這種能力在體外增殖并保持未分化狀態(tài)及其多向分化潛能的生物學(xué)特性，使其廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，它的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值已成為世界范圍內(nèi)研究的熱點。特別是在建立EST（胚胎干細(xì)胞體外測試）、新藥開發(fā)、細(xì)胞組織器官的移植治療和替代治療、轉(zhuǎn)基因動物與克隆上有著廣闊的應(yīng)用前景。

1 EST與新藥開發(fā)

1.1 EST 根據(jù)ES細(xì)胞的特性，有研究者［2］提出了EST預(yù)測模型，經(jīng)過許多研究的驗證發(fā)現(xiàn)ECVAM（歐洲替代方法驗證中心）項目中提出的體外毒性試驗是合理的。關(guān)于EST作為體外篩選和評價受試物的方法也為ECVAM所接受［3］。

EST不僅可以研究藥物的細(xì)胞毒性，還可以研究胚胎發(fā)育毒性。EST與體內(nèi)測試相比，無需考慮藥物在動物體內(nèi)的代謝：與其他體外測試相比，不需大量的動物，其無限傳代的特性可以保證源源不斷的細(xì)胞供應(yīng)；與細(xì)胞毒性測試相比，ES細(xì)胞比成體組織對藥物毒性的敏感性要高，并且更容易檢測受試物和代謝產(chǎn)物的濃度［4］。

EST具體研究過程見參考文獻(xiàn)［2］。于洲等［5］在已經(jīng)建立的ES細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)向心肌細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上利用前期RA（視黃酸）體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，建立ES細(xì)胞向神經(jīng)發(fā)育毒性評價的模型，通過評價了5－FU、DPH、青霉素的神經(jīng)發(fā)育毒性，初步驗證了該方法的有效性，從而對EST評價體系進行了豐富和完善。

1.2 新藥開發(fā) 在藥物研發(fā)過程中體外實驗雖然不能完全取代體內(nèi)實驗，但細(xì)胞實驗可以作為其他實驗的先導(dǎo)，為以后的體內(nèi)實驗提供行之有效的藥理藥代等數(shù)據(jù)，減少實驗所需動物，減低成本。目前藥物開發(fā)過程中所用的細(xì)胞大都來源于動物細(xì)胞或癌細(xì)胞，這些細(xì)胞不能完全反應(yīng)人體對藥物作用的效果。ES細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化成任何組織類型的細(xì)胞，在藥物開發(fā)過程中可以提供大量用于實驗的細(xì)胞。EC（歐共體）建立了一項有針對性的研究項目“InVitroHeart”，旨在開發(fā)人ES細(xì)胞源心肌細(xì)胞的體外毒性試驗。將人心肌細(xì)胞培養(yǎng)與電生理和細(xì)胞毒性微傳感器平臺結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化，已達(dá)到快速篩選藥物的目的［6］。另外，ES細(xì)胞在胚胎毒性測試和肝毒性測試中也取得了很大進展［7］。

ES細(xì)胞還可用于創(chuàng)建動物模型，通過改變動物基因，建立與人類相似疾病的動物模型，應(yīng)用于藥物篩選的過程中，可以準(zhǔn)確、快速的篩選出合適的藥物，目前這種方法已成為藥物篩選的手段之一［8］。近年來，興起的基因打靶技術(shù)是基于同源重組和ES細(xì)胞之上的一種可以定向改變生物體遺傳信息的實驗手段，同源重組是兩段含有相似核苷酸的DNA序列中自發(fā)交換遺傳信息的過程［9］。基因打靶技術(shù)將含有已知序列的DNA片段與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合到受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)［10］。ES細(xì)胞常用做基因打靶的靶細(xì)胞，利用基因打靶技術(shù)將外源DNA與ES細(xì)胞中的相似部分重組或靶向破壞等位基因，創(chuàng)建人類疾病的動物模型［11］。若將修飾過的ES細(xì)胞注入小鼠囊胚中，形成嵌合小鼠。從而在某些特定基因的研究過程中提供豐富的小鼠模型［12］，有研究人員［9］建立了500多個關(guān)于癌癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)疾病等人類疾病的小鼠模型，用于制藥企業(yè)的藥物發(fā)現(xiàn)和篩選。

2 移植治療和細(xì)胞替代治療

ES細(xì)胞在特定條件下可向3個胚層的組織和細(xì)胞分化。3個胚層包括外胚層、中胚層、內(nèi)胚層。外胚層可以分化產(chǎn)生外周、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、上皮系統(tǒng)的細(xì)胞等。中胚層可以分化為肌肉、骨、軟骨、造血和結(jié)締組織及上皮組織等。內(nèi)胚層可以分化成胰細(xì)胞、肝細(xì)胞等［13］。由疾病或外傷導(dǎo)致的細(xì)胞損傷都可以通過將ES細(xì)胞定向分化成的特異性組織細(xì)胞或器官來治療。由于心肌損傷導(dǎo)致的心臟病會使具有完整收縮功能的心肌細(xì)胞的數(shù)量減少，因此治療的關(guān)鍵是要增加具有完整收縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量。Min JY等［14］將經(jīng)過綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的ES細(xì)胞注入由于左冠狀動脈前降支結(jié)扎造成的心肌梗死（MI）引起的損傷心肌上，ES細(xì)胞移植6周后，MI動物心臟功能獲得顯著改善，且MI區(qū)域的心肌切片呈GFP陽性且有典型的條紋、心肌肌節(jié)α－肌動蛋白、心臟α－肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白Ⅰ的強陽性證實移植的細(xì)胞存活和向心肌細(xì)胞的分化。這些數(shù)據(jù)表明，ES細(xì)胞移植是可行的，有望成為治療心肌梗死等心肌損傷性疾病的新方法。

目前臨床上對于燒傷或創(chuàng)傷的患者主要是通過自身皮膚移植來治療，但是嚴(yán)重的燒傷或創(chuàng)傷的患者根本無法進行移植治療，ES細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成表皮干細(xì)胞用于治療燒傷或創(chuàng)傷。劉愛軍等［15］將ES細(xì)胞源性的表皮干細(xì)胞移植到小鼠全層皮膚創(chuàng)傷面上，發(fā)現(xiàn)不僅能修復(fù)缺損表皮，而且有分化為汗腺樣、毛囊樣結(jié)構(gòu)的潛能。

ES細(xì)胞還可以用來治療喪失正常細(xì)胞功能的疾病如退行性病變、遺傳性疾病和腫瘤等。帕金森?。≒D）是由于腦中多巴胺神經(jīng)元丟失而導(dǎo)致的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。迄今，無論是藥物還是手術(shù)治療都無法根治。而利用細(xì)胞替代治療，將ES細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化成產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，再將這些細(xì)胞注入病變區(qū)域，就有可能治療帕金森病。體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法可以采用經(jīng)典五步法，此方法通過模仿體內(nèi)ES細(xì)胞的生長分化環(huán)境，逐步改變ES細(xì)胞的培養(yǎng)液成分，添加不同的生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等，誘導(dǎo)ES細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化。這種方法簡單，對細(xì)胞毒性小，且分化成的多巴胺能神經(jīng)元較純。劉平等［16］利用無血清培養(yǎng)基的篩選和培養(yǎng)，在SHH和FGF8等細(xì)胞因子的共同作用下使其定向分化成為絡(luò)氨酸氫化酶陽性的神經(jīng)元。此外，與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)、基因修飾等方法也可產(chǎn)生純度較高的多巴胺能神經(jīng)元。

許多Ⅰ型糖尿病患者體內(nèi)，生成胰島素的β細(xì)胞及其他功能性細(xì)胞都被破壞。Lumelsky等［17］將ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為能分泌胰島素和其他胰腺內(nèi)分泌激素的正常的胰島細(xì)胞，注入糖尿病鼠后形成了胰島樣結(jié)構(gòu)。如果將這些ES細(xì)胞分化成的胰島樣細(xì)胞移植入患者體內(nèi)，就可能使糖尿病從根本上得到治療。

3 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物與克隆

3.1 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物是基因組中含有外源基因的動物。通過細(xì)胞融合、細(xì)胞重組等技術(shù)將外源基因?qū)刖?、卵子或受精卵中，通過生殖，在后代中形成可能會有攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方法是將目的基因注射到受精卵中，目前人們已成功的獲得了轉(zhuǎn)基因鼠、雞、豬、牛等動物。但此方法只能在個體水平上進行，且工作困難、效率低、周期長。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高，目前可以在細(xì)胞水平上篩選出最佳的細(xì)胞系，通過定向改變ES細(xì)胞，使其攜帶理想的目的基因，再將轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞注入到受精卵中或?qū)⑥D(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞與胚胎共培養(yǎng)，使ES細(xì)胞與正常胚胎形成嵌合體，在下一代中將出現(xiàn)計劃中的轉(zhuǎn)基因動物。這種方法無需大量的動物且周期短，極大地提高了動物的生殖效率。Wood SA等［18］將小鼠胚胎與ES細(xì)胞共同培養(yǎng)，形成嵌合胚，這種方法生產(chǎn)的小鼠ES細(xì)胞嵌合率很高，大大降低了實驗者的時間和精力。轉(zhuǎn)基因動物還可以用來生產(chǎn)基因工程藥物，將某些有預(yù)防或治療作用的藥用蛋白質(zhì)的基因提取出來，導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因動物中，就可以從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁和血液中提取大量的這種藥用蛋白質(zhì)，來滿足臨床和試驗的需求。

3.2 克隆 體細(xì)胞核移植即克隆，是近年來出現(xiàn)的一種新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。體細(xì)胞核移植是將外源基因與供體細(xì)胞共培養(yǎng)，使外源基因整合到供體細(xì)胞上，然后將供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體細(xì)胞（去核卵母細(xì)胞）上，構(gòu)成重建胚，在將其移植到假孕母體上分娩，得到轉(zhuǎn)基因動物。1996年英國制造了第一只體細(xì)胞核移植的克隆的動物綿羊多利。目前已經(jīng)成功克隆出牛、羊、狗等多種動物。有實驗者［19］利用核移植將牛的ES細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，形成重建胚，再移植入牛的受體子宮內(nèi)，后經(jīng)過超聲檢查，發(fā)現(xiàn)有胎兒存活。利用ES細(xì)胞進行核移植可以快速繁育優(yōu)良物種，加快動物的育種工作，在保護珍稀物種方面有重大意義。

4 現(xiàn)存問題

4.1 控制ES細(xì)胞定向分化 細(xì)胞分化是一個復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過程，且ES細(xì)胞容易自主分化，對培養(yǎng)條件要求較高，對多種細(xì)胞因子、培養(yǎng)液環(huán)境等的影響敏感。要誘導(dǎo)ES細(xì)胞向預(yù)期方向分化，必須深入研究分化過程中所需的最佳環(huán)境。

4.2 移植帶來的免疫排斥反應(yīng) ES細(xì)胞移植時會因供體和受體的ABO血型抗原、主要組織相容性抗原、次要組織相容性復(fù)合物抗原的不同而誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)［20］。

4.3 ES細(xì)胞成瘤性 ES細(xì)胞可以無限增殖，如何控制其分化數(shù)量，使其達(dá)到足夠的治療數(shù)目且不會無限增殖而引起畸胎瘤仍需深入研究。

4.4 轉(zhuǎn)基因動物存活率 目前克隆的成功率較低，且克隆成功的動物多數(shù)表現(xiàn)出嚴(yán)重的生理或免疫機能缺陷等問題，最終導(dǎo)致死亡。因此，克隆技術(shù)仍需進一步的研究深入。

除去現(xiàn)有技術(shù)和研究的不足外，影響ES細(xì)胞應(yīng)用的最大問題即倫理問題，其關(guān)鍵問題是如何判定人格和生命。儒家學(xué)者認(rèn)為人是有精神心理活動的有形體，胎兒不具備這些活動，所以不能稱之為人。也有很多社會倫理學(xué)家認(rèn)為胚胎即意味著新的生命開始，其權(quán)利需要得到保護。但更多科學(xué)界人士更傾向于14d內(nèi)的胚胎不是人格的生命，不具備神經(jīng)系統(tǒng)和大腦，不會感覺到疼痛，故而不應(yīng)給予胚胎完全人權(quán)，可以用于生命科學(xué)的研究［21］。

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R331.2

B

1007－4813（2013）02－0319－03

2012－10－28）

中國博士后科學(xué)基金資助項目（200902281）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）資助項目（2011CB505302）。

甄 珍（1987－），女，碩士研究生。研究方向：中藥藥理學(xué)。

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張艷軍，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E－mail：zyjsunye＠163．com。