唐 量，劉晨濤，王園麗，羅 凱，王旭丹

（陜西師范大學體育學院運動分子生物學實驗室，西安710062）

肌肉萎縮一直是人們普遍關注和重視的問題，近年來在肌肉萎縮等相關疾病研究方面Myostatin作為新的靶分子倍受關注［1］。Myostatin基因敲除后出現(xiàn)“雙肌”癥狀被認為是骨骼肌生長發(fā)育中的關鍵負調控因子［2］。本課題組近年來報道了 Myostatin重組蛋白的構建、表達和純化［3］及重組蛋白疫苗對小鼠骨骼肌質量和力量的影響［4］。本實驗在前期研究的基礎上，擬利用基因工程技術構建與 Th細胞表位TT830-844序列融合的人重組 Myostatin基因疫苗真核表達載體pVAC-TT-Ms，為重組Myostatin基因疫苗改善肌肉萎縮等病癥的后續(xù)研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1．1 基因疫苗的構建及體外表達檢測

1．1．1 實驗材料 真核表達載體 pVAC1-cms及抗生素 Zeocin為 Invivogen公司產(chǎn)品；pQE30質粒和LipofectinTM2000脂質體轉染試劑購自Invitrogen公司；核酸片段純化試劑盒和質粒純化試劑盒購自Omega公司；限制性內切酶均為 TaKaRa公司產(chǎn)品；兔抗人Myostatin多克隆抗體為 Bethyl公司產(chǎn)品，熒光標記羊抗兔二抗購自華美生物工程公司。

1．1．2 重組質粒 pVAC-TT-Ms的構建 TT表位序列（Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu）來源于破傷風毒素，具有激活Th細胞的作用。根據(jù)Genebank報道的人Myostatin cDNA序列（No．014793）C-端 330 bp基因片段，合成融合 TT表位的TT-Ms基因序列并克隆至pQE30原核表達載體，重組質粒為pQE-TT-Ms，由上海生物技術工程公司完成基因片段的合成。

為構建融合TT表位的Myostatin基因真核表達載體，利用PCR技術在TT-Ms基因序列5′端和3′端的添加 BamH I和 EcoR I酶切位點。上游引物：5′-CGGGA TC CATT TTG GTC TTG ACT GTG-3′，下游引物：5′-GC GAA TTC TGA GCA CCC ACA GCG-3′，引物由上海生物技術工程公司合成。

PCR擴增體系：總體積為50μl，其中1μl pQETT-Ms模板質粒，5μl的10×PCR緩沖液，5μl MgCl2（25 mmol／L），1μl 4×dNTPs（25 mmol／L），上游和下游引物各 1μl（25μmol／L），1μl Taq DNA聚合酶，用水補足體積至50μl。PCR擴增（PCR儀，美國 Bio-Rad）：95℃預變性 2 min后，94℃變性 1min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)共30次，最后72℃再延伸10 min。

1．1．3 重組質粒 pVAC-TT-Ms的鑒定和純化 用BamH I和EcoR I雙酶切pVAC1-cms質粒，回收酶切基因片段。PCR產(chǎn)物用1．2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段。將目的基因片段 TT-Ms克隆至真核表達載體pVAC1-cms，得到重組質粒 pVAC-TTMs。重組質粒轉染宿主細胞 DH5α，將陽性克隆轉接于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約8 h后提取質粒，進行酶切鑒定和DNA序列分析。將測序正確的質粒在含Zeocin抗生素的LB培養(yǎng)基中進行擴增，采用聚乙二醇沉淀法對重組質粒pVAC-TT-Ms進行純化。

1．1．4 重組質粒 pVAC-TT-Ms轉染CHO細胞及目的蛋白的表達檢測 利用細胞免疫熒光技術對目的蛋白在真核細胞中的表達進行檢測。具體方法為：將CHO細胞用含100 ml／L胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、體積分數(shù)為5%的 CO2條件下培養(yǎng)。以一定密度分別接種于含蓋玻片的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，使80%以上的細胞貼壁。吸出培養(yǎng)液，在無菌管中各加入2μg純化的pVAC-TT-Ms質粒和pVAC1-cms質粒，再分別加入100μl無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)基；在另兩只無菌管中各加入10μl LipofectinTM2000和90μl無血清和抗生素的培養(yǎng)基，室溫放置10 min；分別與前兩管溶液混合，輕輕混勻，室溫放置15 min。分別向脂質體和質粒溶液中加入800μl無血清無抗生素的DMEM，輕輕混勻，移入洗過的CHO細胞中，孵箱中培養(yǎng)7 h，換加1 ml含200 ml／L小牛血清無抗生素的DMEM，在轉染36 h后收獲細胞。取出蓋玻片，用預冷的丙酮固定細胞10 min，在蓋玻片滴加10%小牛血清，室溫封閉30 min，吸掉。滴加兔抗人Myostatin多克隆抗體后4℃冰箱放置過夜。滴加FITC標記的羊抗兔IgG，37℃孵育60 min。甘油封片后立即于熒光顯微鏡（E1000，日本Nikon公司）下觀察并照相。

1．2 動物免疫及抓力測試

由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供雄性BALB／c小鼠，體重 12～14 g，適應性喂養(yǎng) 1周后將動物分為三組：正常對照組、空質粒對照組和基因疫苗組（n＝8）?；蛞呙缃M和空質粒對照組小鼠以純化的質粒 pVAC-TT-Ms和 pVAC1-cms作為抗原，每只按100μg股四頭肌內注射，每隔14 d免疫一次動物，共免疫4次。正常對照組在相同時間和部位注射相同劑量的PBS。第四次免疫20 d后進行抓力測試，方法參考并改進 Peled-Kamar等報道的動物前肢抓力測試方法。主要步驟為在離地高80 cm處綁緊一根直徑2 mm的繩子，讓小鼠前肢握住繩子，并固定尾部，記錄小鼠掉落前持續(xù)握住繩子的時間，即完成一次抓力測試。每只小鼠抓力測試重復3次，重復間隔時間保持一致。

1．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理

所測數(shù)據(jù)用 SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計處理，實驗結果以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，數(shù)據(jù)進行組間均值非成對 t檢驗。

2 結果

2．1 重組質粒 pVAC-TT-Ms的構建

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在約400 bp處有一條與預期大小相符的條帶（圖1）。TT-Ms基因片段經(jīng) EcoR I和 BamH I雙酶切，與同樣雙酶切的pVAC1-cms質粒進行連接，得到重組真核表達質粒pVAC-TT-Ms。經(jīng) EcoR I和 BamH I酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)在約400 bp處有一條帶（圖2），與預期大小相符。構建的重組質粒pVAC-TT-Ms經(jīng)DNA測序，結果完全正確（圖 3）。

Fig．1 PCR production of MyostaitnLane 1：DNA marker；Lane 2：PCR production

Fig．2 Restriction analysis of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms Lane 1：DNA marker；Lane 2：Restriction production

Fig．3 Sequencing result of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

2．2 重組質粒pVAC-TT-Ms的純化

質粒純化結果顯示，pVAC1-cms質粒含量為1．25μg／μl，pVAC-TT-Ms質粒含量為 1．32μg／μl；pVAC1-cms質粒和pVAC-TT-Ms質粒OD260／OD 280比值分別為1．78和1．82，證明質粒不含蛋白質等雜物；電泳結果顯示純化質粒超螺旋、螺旋和線形條帶明晰（圖4）。以上結果證明純化質粒符合轉染細胞的質量要求。

Fig．4 Purification of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

2．3 細胞免疫熒光檢測真核細胞中目的蛋白的表達

細胞免疫熒光技術檢測純化質粒瞬時轉染36 h后的CHO細胞。結果顯示，重組pVAC-TT-Ms質粒轉染的CHO細胞明顯著色，而空質粒pVAC1-cms轉染的 CHO對照細胞無熒光著色（圖5），證明重組pVAC-TT-Ms質粒體外可以在真核細胞CHO中表達目的蛋白。

Fig．5 Detecting the transferring CHOcells with cell immunofluorescence technique（×200）A：CHOcell transfected with pVAC1-cms plasmids；B：CHO cell transfected with pVAC-TT-Ms plasmids；CHO：Chinese hamster ovary

2．4 重組Myostatin基因疫苗對免疫小鼠抓力的影響

小鼠抓力測試結果顯示，對照組小鼠前肢抓力平均時間為（33．50±2．72）s，融合 TT表位的重組Myostatin基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫的小鼠前肢抓力平均時間為（47．78±3．51）s，與對照組比較提高顯著，免疫小鼠前肢抓力平均增加了29．88%（圖6A）。為了排除體重對抓力的影響，進一步分析免疫小鼠抓力與體重的比值，結果與正常對照組小鼠比較，基因疫苗免疫小鼠平均增加了24．31%，增加顯著（圖 6B）。

3 討論

廢用性肌肉萎縮一直是人們普遍關注和重視的問題，許多學者對廢用性肌萎縮的治療進行了深入研究，但仍無突破性進展。Myostatin作為骨骼肌生長發(fā)育的關鍵負調控因子，在廢用性肌肉萎縮方面的研究倍受關注。

本實驗選用人重組 Myostatin基因疫苗免疫誘導特異性抗體進而抑制其體內活性，而構建人重組Myostatin基因疫苗的關鍵是打破免疫耐受。Th細胞表位TT序列，有利于自身的免疫系統(tǒng)所識別，誘發(fā)免疫反應。本實驗在構建 Myostatin基因疫苗時N-端融合了Th細胞表位TT序列，以打破Myostatin免疫時耐受，增強Myostatin基因疫苗的免疫效果。

Fig．6 Grip test in immunized miceA：Relationship of grip time（x-axis）to body weight（y-axis）for each animal；B：Average value of the grip time／body weight．The average value of the time／body weight of the mice immunized with pVAC-TT-Ms was about 24．31%greater than that of control mice*P＜0．05 vs control

質粒pVAC1-cms是一種高效和安全的基因疫苗專用質粒。將Myostatin成熟肽基因片段克隆至pVAC1-cms質粒IL-2的信號肽序列和胎盤堿性磷酸酶（PLAP）的跨膜錨定位點序列之間，確保表達的抗原蛋白被錨定在細胞的表面，以增強免疫應答。重組質粒pVAC-TT-Ms由脂質體介導，轉染CHO細胞，使外源目的蛋白整合穩(wěn)定，并高效擴增和表達目的蛋白。

本實驗將多種優(yōu)勢結合，首次構建融合 Th細胞表位序列人重組 Myostatin基因疫苗真核表達載體pVAC-TT-Ms，瞬時轉染 CHO細胞并免疫熒光技術檢測，目的蛋白在轉染的 CHO細胞中明顯表達。測定OD260和OD280比值和電泳分析表明，重組質粒pVAC-TT-Ms質量符合免疫動物時基因疫苗的要求。重組質粒pVAC-TT-Ms免疫小鼠可顯著提高免疫小鼠前肢的抓力。

Whittemore等［5］報道動物體內注射 Myostatin的特異性抗體，可抑制 Myostatin的活性，進而提高動物骨骼肌質量和力量。雖然 Myostatin抗體在治療肌肉相關疾病的過程中效果良好，由于純化困難、造價昂貴等不便限制了抗體的廣泛應用，因此，研發(fā)針對該蛋白主動免疫的疫苗有更好的應用前景。下一步課題組計劃比較 Myostatin基因疫苗的量效和時效關系，分析該疫苗提高免疫動物骨骼肌質量和力量的分子機制，為重組 Myostatin基因疫苗治療廢用性肌肉萎縮等病癥方面的應用提供實驗基礎。

［1］ Elkina Y，von Haehling S，Anker SD，et al．The role of myostatin in muscle wasting：an overview［J］．J Cachexia Sarcopenia Muscle，2011，2（3）：143-151．

［2］ McPherron A C，Lawler A M，Lee SJ．Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member［J］．Nature，1997，387（6628）：83-90．

［3］ 唐 量，王園麗，張萬金，等．Myostatin基因原核表達載體的構建及蛋白表達、純化與鑒定［J］．陜西師范大學學報（自然科學版），2010，38（6）：77-81．

［4］ 唐 量，張萬金，王園麗，等．Myostatin重組蛋白疫苗對小鼠骨骼肌質量和力量的影響［J］．中國運動醫(yī)學雜志，2011，30（2）：149-153．

［5］ Whittemore L A，Song K，Li X，et al．Inbibition of myostatin in adult mice increnses skeletal muscle mass and strength［J］．Biochem Biophys Res Commun，2003，300（4）：965-971．