郝春艷，段虎斌，劉學(xué)軍，習(xí) 玲，高 嶺，白春愛，鄭小俊，滕萍萍，羅非同，王鳳芝，李茹香

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種發(fā)生在血管內(nèi)膜表面由于結(jié)構(gòu)異常以及代謝紊亂而導(dǎo)致的疾?。?］。AS的動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小，可以造成血管狹窄或阻塞導(dǎo)致組織器官缺血缺氧或壞死，是嚴(yán)重危害健康的“殺手”［2］。熱休克蛋白60（HSP60）在AS發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可作為自身抗原引發(fā)血管壁的免疫反應(yīng)，啟動(dòng)AS的形成并促進(jìn)AS進(jìn)一步發(fā)展［3］。本研究將HSP60作為耐受原，研究口服HSP60誘導(dǎo)免疫耐受和抗AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器 流式細(xì)胞儀（FACS Calibur型，美國(guó)Becton-Dickinson公司），酶標(biāo)儀（Novapath TM型，美國(guó)BIO-RAD公司），圖像分析系統(tǒng)（MIAS-2000型，中國(guó)四川川大智勝軟件股份有限公司），HSP60抗原（中國(guó)北京博奧生生物技術(shù)公司），維生素D3粉劑（飼料級(jí)，浙江花園生物高科股份有限公司），注射維生素D3針劑（中國(guó)江蘇吳中實(shí)業(yè)股份有限公司蘇州第六制藥廠），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）ELISA kit（美國(guó) Santa Cruz公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 4周齡健康雄性SD大鼠40只，體重100 g±10 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組：健康對(duì)照組（C組），動(dòng)脈粥樣硬化未干預(yù)組（AS組），造模前口服HSP60組（H1組），造模后口服HSP60組（H2組），以上4組每組10只。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 造模及標(biāo)本采集 H1組先于造AS模型前30 d開始用HSP60灌胃，每日一次，其余3組喂飼普通飼料和500μL PBS液灌胃；于出生后60 d，C組繼續(xù)喂飼普通飼料，AS組、H1組、H2組開始喂飼高脂飼料和維生素D3粉劑90 d，建立AS大鼠模型，于出生后150 d各組停止高脂飲食，H2組開始用HSP60灌胃，C組、AS組和H1組仍以500μL PBS液灌胃，4個(gè)組均灌胃30 d。采用ELISA法檢測(cè)各組血清中TGF-β含量；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血清CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量。

1.3.2 制作標(biāo)本 石蠟切片后HE染色及采用圖像分析系統(tǒng)照相分析，觀察各組大鼠主動(dòng)脈病理改變，計(jì)算血管內(nèi)膜（IT）與血管內(nèi)徑（ID）之比（IT／ID）。

1.3.3 ELISA檢測(cè)血清TGF-β含量 應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中TGF-β水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TGF-β抗原、生物素化的抗大鼠TGF-β抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

1.3.4 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè) 流式細(xì)胞儀用前向角（Fsc）測(cè)向角（Ssc）設(shè)二維點(diǎn)圖，用Gate1將淋巴細(xì)胞圈住，檢測(cè)Gate1內(nèi)細(xì)胞10 000個(gè)。獲取熒光信號(hào)并分析數(shù)據(jù)的軟件均使用CELLQUEST軟件，用對(duì)數(shù)方式分別以FL1-FL3，F(xiàn)L2-FL3作二維點(diǎn)圖，檢測(cè)CD4、CD25、Foxp3陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件。數(shù)據(jù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示；同一組不同時(shí)間均數(shù)比較采用重復(fù)資料方差分析；多組間均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)（方差齊）和Dunnett’sT檢驗(yàn)（方差不齊），相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水平為雙側(cè)α＝0.05，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

高脂飲食可形成AS斑塊，AS組主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂，部分血管內(nèi)膜突起，淋巴細(xì)胞、炎性細(xì)胞、泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維斷裂，斑塊形成斑塊處可形成夾層動(dòng)脈瘤，甚至斑塊有破裂出血。實(shí)驗(yàn)組IT／ID、血清TGF-β和CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量較對(duì)照組均高（P＜0.05）；H1組和H2組較A組IT／ID值為低（P＜0.05）；H2組較 H1組為高（P＜0.05）。外周血中CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與細(xì)胞因子TGF-β含量相關(guān)性分析示：二者成正相關(guān)（r＝0.854 6，t＝10.145 1，P＜0.05）；直線回歸方程：Y＝-11.432 1＋52.541 7X（F＝102.922 2，P＜0.05）。

表1 大鼠主動(dòng)脈IT／ID、血清TGF-β和CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量（±s）

表1 大鼠主動(dòng)脈IT／ID、血清TGF-β和CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量（±s）

組別 IT／ID%TGF-β pg／m L CD4＋CD25＋FoxP3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞比例（%）C組6.1±1.3 88.7±20.1 2.55±0.36 A組 38.3±6.51） 53.6±15.41） 1.66±0.361）H1組 15.8±7.41）2） 291.9±71.71）2） 5.58±0.221）2）H2組 26.9±3.31）2）3）161.3±49.61）2）3） 3.28±0.611）2）3）與C組比較，1）P＜0.05；與A組比較，2）P＜0.05；與 H1組比較，3）P＜0.05

3 討 論

AS形成發(fā)展中，有大量與免疫相關(guān)的細(xì)胞參與并形成了一系列免疫反應(yīng)機(jī)制，主要包括：免疫系統(tǒng)的單核、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，特別是T淋巴細(xì)胞，它們?cè)诟鞣N免疫分子的協(xié)調(diào)下相互作用，相互影響，共同參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，故現(xiàn)在許多學(xué)者開始把AS視為一種慢性炎癥反應(yīng)或自身免疫性疾病［4］。動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷與抗原的識(shí)別是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，在動(dòng)脈粥樣損害的早期階段即有活化的免疫細(xì)胞在斑塊局部浸潤(rùn)和熱休克蛋白（HSP）的表達(dá)［5］。HSP60是一種主要由受刺激以及死亡的內(nèi)皮細(xì)胞分泌和釋放的蛋白，在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受外界因素如應(yīng)激、高血壓、感染等刺激時(shí)，可引起HSP60的表達(dá)，被樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所識(shí)別，從而觸發(fā)自身免疫反應(yīng)。HSP60與AS密切相關(guān)，Xu等［6］調(diào)查發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣損害的高危人群的血清中含有高滴定的HSP60抗體。急性冠脈綜合征病人的體內(nèi)存在HSP60特異性T細(xì)胞，證明HSP60是重要的斑塊相關(guān)抗原［7］?？诜褪埽∣T）是指口服抗原后，引起機(jī)體對(duì)該抗原產(chǎn)生特異性無(wú)或低免疫性應(yīng)答，但對(duì)其他抗原仍可產(chǎn)生正常免疫性反應(yīng)［8］。CD4＋CD25＋FoxP3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在口服誘導(dǎo)免疫耐受中起重要作用［9］。TGF-β表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4與抗原提呈細(xì)胞和黏膜內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)的CD80／CD86結(jié)合，還表達(dá)高水平的免疫抑制相關(guān)分子糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子（TNF）樣受體（GITR），發(fā)揮免疫抑制、誘導(dǎo)免疫耐受作用［10］。

本實(shí)驗(yàn)顯示，口服HSP60能夠產(chǎn)生免疫耐受，表現(xiàn)為口服HSP60組CD4＋CD25＋Foxp3＋ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在外周血中含量增加，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的具有抑制免疫、誘導(dǎo)免疫耐受的TGF-β等細(xì)胞因子在外周血中含量也增加，相反，動(dòng)脈粥樣硬化組上述指標(biāo)在降低，上述各指標(biāo)之間成正相關(guān)。預(yù)防組較治療組誘導(dǎo)免疫耐受效果好，提示越早口服HSP60誘導(dǎo)免疫耐受效果越好。本研究對(duì)理解口服HSP60誘導(dǎo)免疫耐受抗AS機(jī)制有一定幫助，對(duì)開闊臨床上治療AS新思路也有一定益處。

［1］ Chen MA，Kawakubo M，Colletti PM，et al.Effect of age on aortic atherosclerosis［J］.J Geriatr Cardiol，2013，10（2）：135-140.

［2］ Hamamdzic D，Wilensky RL.Porcine models of accelerated coronary atherosclerosis：Role of diabetes mellitus and hypercholesterolemia［J］.J Diabetes Res，2013，2013：761415.

［3］ Grundtman C，Kreutmayer SB，Almanzar G，et al.Heat shock protein 60 and immune inflammatory responses in atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（5）：960-968.

［4］ Peter Libby，Paul M Ridker，G?ran K，et al.Inflammation in Atherosclerosis：From Pathophysiology to Practice［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54（23）：2129–2138.

［5］ Grundtman C，Kreutmayer SB，Almanzar G.Heat shock protein 60 and immune inflammatory responses in atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（5）：960-968.

［6］ Xu Q，Metzler B，Jahangiri M，et al.Molecular chaperones and heat shock proteins in atherosclerosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012 ，302（3）：H506-514.

［7］ Curry AJ，Portig I，Goodall JC，et al.T lymphocyte lines isolated from atheromatous plaque contain cells capable of responding to Chlamydia antigens［J］.Clin Exp Immunol，2000 ，121（2）：261-269.

［8］ Stanley S.Oral tolerance of food［J］.Curr Allergy Asthma Rep，2002，2（1）：73-77

［9］ Matta B，Jha P，Bora PS，et al.Tolerance to melanin-associated antigen in autoimmune uveitis is mediated by CD4＋CD25＋T-regulatory cells［J］.Am J Pathol，2008，173（5）：1440-1454.

［10］ Park JJ，Omiya R，Matsumura Y，et al.B7-H1／CD80 interaction is required for the induction and maintenance of peripheral T-cell tolerance［J］.Blood，2010，116（8）：1291-1298.