陳世豐，袁 磊，范文娟，陳旭東

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校組織與胚胎學(xué)教研室，2.分子醫(yī)學(xué)實驗中心，河南漯河462002）

多年來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要途徑，但胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）系統(tǒng)卻一直是大家關(guān)注的焦點(diǎn)。IGF系統(tǒng)是由IGFs、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding proteins，IGFBPs）、胰島素受體和 IGF受體構(gòu)成。IGFBPs能有效延長IGFs的半衰期，影響IGFs與其受體的結(jié)合。在腫瘤形成過程中，尤其是當(dāng)良性腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變時，往往能檢測到IGF系統(tǒng)的異常變化，如前列腺癌、乳腺癌和肺癌。

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP7）屬IGFBP超家族成員，由282個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為33 kDa。IGFBP7廣泛存在于各類體液中，如血清、尿液、腦脊液和羊水等，血清中 IGFBP7的含量約為 21.0μg／L（中位數(shù)）。IGFBP7表達(dá)于各類正常組織器官，在衰老的組織中其表達(dá)顯著增強(qiáng)，然而在多種腫瘤組織中其表達(dá)卻下調(diào)甚至缺失［1］。IGFBP7陰性表達(dá)的結(jié)直腸腫瘤往往比IGFBP7陽性者具有更低的分化程度、更高的惡性程度以及更差的預(yù)后［2］，因此IGFBP7可作為特異性標(biāo)志物用于直結(jié)腸腫瘤的病理學(xué)和血清學(xué)診斷。

為了進(jìn)一步探究外源性IGFBP7對結(jié)直腸腫瘤的生物學(xué)功能，本研究將通過IGFBP7真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT29），以探究IGFBP7過表達(dá)對HT29細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

HT29細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，大腸桿菌菌株DH5α由學(xué)校分子醫(yī)學(xué)實驗中心提供。

1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和G418購自GIBCO公司；質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7購自O(shè)RIGENE公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自北京天根公司；限制性核酸內(nèi)切酶Sgf I和Not I、T4DNA聚合酶和T4連接酶購自大連寶生物公司；Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒購自QIAGEN公司；PI染液、兔抗人IGFBP7抗體和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Sigma公司。

1.3 HT29細(xì)胞的培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HT29細(xì)胞，每隔48 h更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。待HT29細(xì)胞覆蓋瓶底達(dá)80%以上時，用0.125%胰蛋白酶消化傳代。實驗前更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7的酶切鑒定及空質(zhì)粒制備

以DH5α大腸桿菌制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7，37℃過夜，挑取單菌落，置于含有氨芐青霉素（AMP）的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r／min過夜。采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒 pCMV6-IGFBP7。將質(zhì)粒 pCMV6-IGFBP7于37℃由限制性核酸內(nèi)切酶Sgf I和Not I酶切過夜，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用DNA純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠中pCMV6質(zhì)粒片段，先用T4DNA聚合酶將質(zhì)粒片段末端平滑化，再經(jīng)T4連接酶連接后即為空質(zhì)粒pCMV6。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

采用Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒，將質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7和空質(zhì)粒pCMV6分別轉(zhuǎn)染入HT29細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后用PBS洗去轉(zhuǎn)染試劑，加入新鮮的培養(yǎng)基和G418（終濃度為 0.5 mg／ml），繼續(xù)培養(yǎng) 2周，即可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。

1.6 實驗分組

實驗分成三組：Control組：HT29細(xì)胞；Empty組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMV6的HT29細(xì)胞；IGFBP7組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV6-IGFBP7質(zhì)粒的HT29細(xì)胞。

1.7 檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中IGFBP7的表達(dá)

采用Western blot分析方法，以微管蛋白（tubulin）為內(nèi)參蛋白，檢測各實驗組IGFBP7的表達(dá)。先提取各實驗組細(xì)胞總蛋白，然后檢測各組樣品中蛋白含量，經(jīng)SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，將PVDF膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h，先加入一抗（兔抗人IGFBP7抗體）室溫下孵育1 h，再加入二抗（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG）室溫下孵育1 h，最后將PVDF膜經(jīng)DAB顯色后拍照保存。

1.8 HT29細(xì)胞凋亡檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)PI染色法。制備各實驗組細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液漂洗兩次，然后用70%冰乙醇于4℃固定24 h，再用PBS洗2次，加入1 ml PI染液，4℃避光染色30 min，送流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 酶切質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7

質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7經(jīng)Sgf I和Not I酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像系統(tǒng)檢測顯示，質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7長度為6 kbp。酶切產(chǎn)生的pCMV6質(zhì)粒片段和IGFBP7片段長度分別為4.9 kbp和1.1 kbp。空質(zhì)粒實際長度為4.9 kbp（圖 1）。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of plasmid and restriction fragment

2.2 IGFBP7的表達(dá)

Control組和Empty組均不表達(dá)IGFBP7蛋白，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV6-IGFBP7質(zhì)粒的IGFBP7組HT29細(xì)胞高表達(dá)IGFBP7蛋白（圖 2）。

2.3 細(xì)胞凋亡

HT29細(xì)胞IGFBP7組細(xì)胞凋亡率為17.33%±2.25%，顯著高于其他各組（P＜0.01）；Control組和 Empty組的細(xì)胞凋亡率分別為4.35%±0.87%和 4.61%±0.91%，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3）。

Fig.2 Expression of IGFBP7 protein in each experimental group

Fig.3 Effect of IGFBP7 on apoptosis of HT29 cells（n＝3）

3 討論

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)生的pCMV6質(zhì)粒片段和IGFBP7片段長度分別為4.9 kbp和1.1 kbp，與Marker指示大小一致，但質(zhì)粒pCMV6-IGFBP7和空質(zhì)粒pCMV6的實際大小與Marker不符合，這是由于環(huán)狀的質(zhì)粒比同樣長度的線狀DNA片段空間位阻小、電泳速度快。Western blot結(jié)果顯示，只有IGFBP7組HT29細(xì)胞高表達(dá)IGFBP7蛋白，這表明穩(wěn)定表達(dá)IGFBP7的人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系構(gòu)建成功。

本研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP7過表達(dá)能夠顯著誘導(dǎo)人直腸癌HT29細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式之一。線粒體是細(xì)胞生命活動控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。在凋亡發(fā)生過程中，多種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bak、Bax和tBid等Bcl-2家族蛋白，轉(zhuǎn)移至線粒體，破壞線粒體膜的通透性和完整性，導(dǎo)致線粒體膜電位去極化和多種凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放，如細(xì)胞色素C（Cyt c）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）和 pro-Caspase-9等，繼而活化Caspase3，6和7，最終引起細(xì)胞凋亡。

Tomimaru等人研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用siRNA技術(shù)干擾IGFBP7在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株P(guān)LC和PRF細(xì)胞中的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞凋亡、活化 ERK1／2信號通路和下調(diào) p27等蛋白的表達(dá)［3，4］。Wajapeyee等人將 IGFBP7真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染至BRAFV600E陽性的人黑色素瘤細(xì)胞系中則可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制ERK1／2信號通路活化［5］。黑素瘤RAF基因約有50%～70%左右發(fā)生突變，而90%以上RAF基因突變都是在V600E處由谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸，這種突變增加了Raf蛋白的活性，導(dǎo)致Raf→MEK→ERK信號通路異?；罨?，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。Wajapeyee等人研究也證實，IGFBP7缺失是RAF基因發(fā)生突變的關(guān)鍵［5］。

綜上所述，IGFBP7高表達(dá)可促進(jìn)人直腸癌HT29細(xì)胞凋亡，這可能與抑制ERK1／2信號通路活化有關(guān)，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的探討。

［1］ Chen Y，Pacyna-Gengelbach M，Ye F，et al.Insulin-like growth factor binding protein-related protein 1（IGFBP-rP1）has potential tumour-suppressive activity in human lung cancer［J］.JPathol，2007，211（4）：431-438.

［2］ Ruan W，Xu E，Xu F，et al.IGFBP7 plays a potential tumor suppressor role in colorectal carcinogenesis［J］.Cancer Biol Ther，2007，6（3）：354-359.

［3］ Tomimaru Y，EguchiH，Wada H，etal.Insulin-like growth factor-binding protein 7 alters the sensitivity to interferonbased anticancer therapy in hepatocellular carcinoma cells［J］.Br JCancer，2010，102（10）：1483-1490.

［4］ Tomimaru Y，EguchiH，Wada H，etal.IGFBP7 downregulation is associated with tumor progression and clinical outcome in hepatocellular carcinoma［J］.Int J Cancer，2012，130（2）：319-327.

［5］ Wajapeyee N，Serra RW，Zhu X，et al.Oncogenic BRAF induces senescence and apoptosis through pathwaysmediated by the secreted protein IGFBP7［J］.Cell，2008，132（3）：363-374.