池建偉 李 陽 張 虹 胡 鵬 傅 紅

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院1，福州 350108)

(豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司2，上海 200137)

甾醇類化合物在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)和控制作用，植物甾醇可以抑制以膽固醇為代表的動物甾醇在人體腸腔內(nèi)的水解和再酯化，并作為競爭者降低飽和脂肪代謝過程中形成的膽固醇數(shù)量，從而減少膳食中動物甾醇和飽和脂肪對人體高血脂、糖尿病、心腦血管疾病的不利影響[1－4]。其中，β－谷甾醇和γ－谷維素可以明顯降低血漿中低密度脂蛋白(LDL)及膽固醇量，沒有毒副作用，并且γ－谷維素還具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)以及內(nèi)分泌等多種生理活性功能[5－10]。因此，它們在許多國家被允許作為新資源食品或食品添加劑[11－13]。

近年的國外研究表明，β－谷甾醇與γ－谷維素的混合物在純油相中可以形成牢固透明的凝膠，甚至在某些條件下形成自組裝的晶體形態(tài)[14－17]。按照分子結(jié)構(gòu)形成所需最低能量原則推測，由于β－谷甾醇與γ－谷維素的甾醇單元分別位于結(jié)構(gòu)的一端，而γ－谷維素的阿魏酸位于結(jié)構(gòu)的伸出部位，其輕微的楔形結(jié)構(gòu)為彎曲的超分子結(jié)構(gòu)留下空間[17]，這為β－谷甾醇與γ－谷維素可能通過分子間氫鍵并進(jìn)一步形成自組裝的晶體狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提供了一定的理論依據(jù)。但是，至今國內(nèi)外的研究對晶體結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理缺乏有效的分析驗(yàn)證。本試驗(yàn)建立了傅里葉紅外光譜法表征β－谷甾醇與γ－谷維素氫鍵形成的方法，用偏光顯微鏡下觀察其在油脂體系中的晶體形態(tài)，并對其質(zhì)構(gòu)特性做了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

β－谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品:上海晶純試劑有限公司；γ－谷維素標(biāo)準(zhǔn)品:日本東京化成工業(yè)株式會社；大豆油等植物油脂:嘉里特種油脂(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BK－POL偏光顯微鏡:奧特光學(xué)儀器有限公司；YP802N電子天平:上海精科實(shí)業(yè)有限公司；尼高力360智能型傅里葉紅外光譜儀:美國尼高力儀器公司；HJ－4A多頭加熱磁力攪拌器:國華儀器有限公司；DC0506W恒溫水浴鍋:上海方瑞儀器有限公司；TA－XT2質(zhì)構(gòu)儀:英國 Stable Micro System公司；WZR錐入度:上海精密科學(xué)實(shí)驗(yàn)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的傅里葉紅外光譜分析

1.3.1.1 β－谷甾醇和γ－谷維素樣品準(zhǔn)備

將β－谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品在150℃下加熱至完全溶解，γ－谷維素標(biāo)準(zhǔn)樣品在170℃下加熱至完全溶解，分別緩慢冷卻至室溫，研磨備用。

1.3.1.2 β－谷甾醇和γ－谷維素物理混合物樣品準(zhǔn)備

按照1.3.1.1的方法，分別將研磨好的β－谷甾醇與γ－谷維素進(jìn)行充分的物理混合，備用。

1.3.1.3 β－谷甾醇和γ－谷維素化合物熔融樣品準(zhǔn)備

按一定比例混合β－谷甾醇和γ－谷維素樣品，在170℃下加熱至完全熔融，緩慢冷卻至室溫，備用。

1.3.1.4 傅里葉紅外光譜分析

研磨以上各備用干燥樣品，與200 mg純KBr研細(xì)混合至粒度小于2μm，在油壓機(jī)上壓成透明薄片，用于傅里葉紅外光譜儀分析。

1.3.2 樣品結(jié)晶形態(tài)的偏振光顯微鏡分析

1.3.2.1 β－谷甾醇和γ－谷維素的油相樣品

按一定比例混合β－谷甾醇和γ－谷維素的樣品，定量加入植物油脂中，于70℃水浴下溶解，不斷緩慢攪拌成透明黃色，冷卻至室溫，放置在4℃的恒溫培養(yǎng)箱中24 h以上，至結(jié)構(gòu)穩(wěn)定呈現(xiàn)透明的凝膠狀。

1.3.2.2 樣品晶體形態(tài)分析

取適量樣品分別于載玻片上，蓋上蓋玻片，壓成均勻薄片后用連接Canon數(shù)碼相機(jī)的偏振光顯微鏡觀察樣品的結(jié)晶形態(tài)，觀察溫度為25℃，顯微鏡放大倍數(shù)為200。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)分析

用質(zhì)構(gòu)儀TPA2模式，以直徑為5 mm的探頭(P/5)測樣品硬度值。測試前速度:1.0 mm/s；測試速度:3.0 mm/s；測試后速度:3.0 mm/s；1次距離:10.0 mm；2次距離 10.0 mm；間隔時間:5.00 s。

1.3.4 錐入度值分析

將樣品放于圓形容器內(nèi)，啟動錐入度計(jì)5 s以后，讀取錐入深度值(mm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 β－谷甾醇與γ－谷維素的鍵合特征分析

通過分子官能團(tuán)吸收峰的變化特征，紅外光譜法成為表征氫鍵形成效應(yīng)的有效手段之一。在紅外光譜中，當(dāng)分子間氫鍵增強(qiáng)時，形成氫鍵的羥基基團(tuán)的伸縮振動吸收峰將向低波數(shù)位移，并導(dǎo)致譜帶變寬[18－19]。

β－谷甾醇和γ－谷維素的分子結(jié)構(gòu)分別如圖1所示，β－谷甾醇以環(huán)戊烷全氫菲為骨架(又稱甾核)，分子內(nèi)有一個羥基基團(tuán)在箭頭A所指位置上；γ－谷維素是阿魏酸與植物甾醇的結(jié)合脂，分子內(nèi)的羰基在箭頭B所指位置上[14，17]。從氫鍵的形成機(jī)理分析，β－谷甾醇可以通過羥基(R—O—H)與γ－谷維素中電負(fù)性強(qiáng)的羰基(—C＝O)氧原子，形成分子間氫鍵R—O—H…O—R′。

圖1 β－谷甾醇與γ－谷維素的分子結(jié)構(gòu)式

圖2是β－谷甾醇和γ－谷維素的紅外光譜圖?？梢妶D2a中β－谷甾醇的—OH伸縮振動的特征吸收峰，其波數(shù)在3 440.84 cm－1，圖2b中γ－谷維素的羰基特征伸縮振動的吸收峰在1 710.49 cm－1。

圖2 β－谷甾醇與γ－谷維素紅外光譜圖

分子間氫鍵形成的程度和樣品的濃度有關(guān)[15－16]。對比不同配比的β－谷甾醇與γ－谷維素鍵合的紅外光譜，結(jié)果如圖3所示。

圖3顯示了不同配比的β－谷甾醇和γ－谷維素化合物的紅外光譜圖，其中β－谷甾醇的—OH伸縮振動峰和γ－谷維素的羰基吸收峰均出現(xiàn)了程度不等的低波數(shù)位移，而其他分子官能團(tuán)特征吸收峰則沒有出現(xiàn)位移。

圖3 不同配比的β－谷甾醇和γ－谷維素化合物的紅外光譜圖

如圖3a和圖3d所示，當(dāng)β－谷甾醇與γ－谷維素(m/m)1∶4和4∶1時，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數(shù)位移程度較少；當(dāng)β－谷甾醇與γ－谷維素(m/m)為3∶2時，如圖3c，β－谷甾醇的羥基伸縮振動吸收峰出現(xiàn)明顯的低波數(shù)移動，從圖1a的3 440.18 cm－1移到3 301.25 cm－1；尤其在 β－谷甾醇與γ－谷維素(m/m)2:3時，如圖3b所示，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數(shù)移動的程度最大，其紅外吸收峰的波數(shù)為3 145.68 cm－1。

從圖3可知，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數(shù)移動，表明β－谷甾醇分子內(nèi)的羥基和γ－谷維素電負(fù)性較強(qiáng)的羰基上氧原子產(chǎn)生了分子間氫鍵；當(dāng)β－谷甾醇與γ－谷維素的比例不同時，發(fā)生的氫鍵效應(yīng)強(qiáng)弱不同，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰位移程度也不同；當(dāng)β－谷甾醇與γ－谷維素質(zhì)量比在2:3時，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數(shù)移動最顯著，暗示此時分子間的氫鍵效應(yīng)最大。

β－谷甾醇的分子質(zhì)量為415 u，γ－谷維素的分子質(zhì)量大約為600 u，當(dāng)它們配比為2∶3時，β－谷甾醇和γ－谷維素的分子摩爾比大約為1∶1，在此情況下，一分子β－谷甾醇和一分子γ－谷維素可以形成最大氫鍵鍵合比率，氫鍵效應(yīng)最顯著。

β－谷甾醇與γ－谷維素粉末物理混合物的紅外光譜圖如圖4，和圖3比較，可以看出β－谷甾醇—OH伸縮振動吸收峰與γ－谷維素羰基伸縮振動吸收峰沒有發(fā)生位移。由此可以說明，β－谷甾醇與γ－谷維素的氫鍵鍵合紅外圖譜不同于其物理混合物。

圖4 β－谷甾醇與γ－谷維素物理混合物紅外光譜

2.2 β－谷甾醇與γ－谷維素的自組裝體系結(jié)晶態(tài)特征

將β－谷甾醇、γ－谷維素以及它們的鍵合物，按照相同的添加總量溶解在植物油脂體系中，用偏振光顯微鏡觀察它們所形成晶體的大小和形態(tài)，如圖5、圖6所示。

β－谷甾醇在油相中的晶體形態(tài)，如圖5a所示，呈現(xiàn)均勻分散、大小一致的長形管束狀，晶體長度約為21.0μm。γ－谷維素在油相中呈透明態(tài)，圖5b為其在油相中偏振光顯微鏡圖像，可以看出γ－谷維素完全溶解在油相中，無結(jié)晶體產(chǎn)生。

圖5 β－谷甾醇和γ－谷維素在油相中的偏振光顯微鏡圖像

圖6為一系列的β－谷甾醇和γ－谷維素自組裝鍵合物，以不同配比溶解到油相中。從偏光顯微鏡圖像可以看出，它們的結(jié)晶形態(tài)有明顯的差異。

圖6 不同配比的β－谷甾醇和γ谷維素(m/m)偏振光顯微鏡圖像

當(dāng)β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例為1∶4時，如圖6a所示，油相中只有分布均勻的、極為細(xì)小的點(diǎn)狀晶粒，沒有看到其他形態(tài)的晶體。這是因?yàn)樵诖梭w系下，難以獨(dú)立成晶的γ谷維素的比例遠(yuǎn)高于β－谷甾醇，使油相中β－谷甾醇的分散程度加大，相應(yīng)減少了β－谷甾醇晶核的聚集和繼續(xù)生長，導(dǎo)致油相中的晶體未能成型。

但是，當(dāng)β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例達(dá)到2:3時，如圖6b所示，油相中除了有β－谷甾醇結(jié)晶體外，還出現(xiàn)了新的晶體形態(tài)，并聚集成簇，晶體長度約為20.0μm。不同于圖5a中β－谷甾醇長形、管束狀晶體，新的晶體呈現(xiàn)規(guī)則緊密的四瓣形聚集態(tài)，形似雛菊，每瓣由3～4個向四周發(fā)射的長形管狀構(gòu)成，晶體中心具有中空的楔形形狀，這種楔形空間，可能更利于彎曲的超分子結(jié)構(gòu)的形成[17]。同時。還可以看出，零星的管束狀β－谷甾醇晶體，分散在成簇的新晶體周圍。這說明β－谷甾醇和γ谷維素通過氫鍵相互吸引，并有規(guī)則地組合、排列，構(gòu)建成一種自組裝的新晶體。

當(dāng)β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例提高到3∶2時，晶體形態(tài)如圖6c所示。和圖6b相比，新晶體的聚集程度略有降低，晶體之間的距離變得更大，晶體長度也略有增加，約為23.0μm；同時，油相中分布著更多的管束狀的β－谷甾醇晶體。這意味著β－谷甾醇和γ谷維素鍵合的氫鍵數(shù)目減少，導(dǎo)致自組裝的新晶體數(shù)量下降，晶體結(jié)構(gòu)開始變得松散。

圖6d是β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例高達(dá)4∶1時的偏光顯微圖像，油相中只出現(xiàn)了數(shù)目極少的、不完全的四瓣形新晶體，大多數(shù)是長度約為27.0 μm的、不規(guī)則纖維狀結(jié)構(gòu)的β－谷甾醇管狀晶體聚合物。由于β－谷甾醇在油相中可以獨(dú)立成晶，因此和圖6a相比，當(dāng)β－谷甾醇添加比例較大時，更容易形成自組裝新晶體。

以上結(jié)果表明，β－谷甾醇和γ谷維素在油相中以分子間氫鍵相互吸引時，可形成自組裝新晶體；晶體的形態(tài)和數(shù)量隨著β－谷甾醇和γ谷維素的比例，即氫鍵形成的數(shù)目而發(fā)生明顯的變化。

2.3 質(zhì)構(gòu)及錐入度分析

從質(zhì)構(gòu)特性分析，β－谷甾醇∶γ－谷維素(m/m)＝2∶3即β－谷甾醇和γ－谷維素形成氫鍵比率最高時，它們在油相中硬度最大，錐入度值最小(圖7)。當(dāng) β－谷甾醇∶γ－谷維素(m/m)＝1∶4以及4∶1時，油相體系呈流動狀態(tài)，并未檢測到有效數(shù)值。這一結(jié)果，與紅外光譜分析及偏振光顯微鏡分析一致。

圖7 TPA測試以及錐入度值分析

3 結(jié)論

β－谷甾醇上的羥基與γ－谷維素上的羰基可以通過分子間氫鍵進(jìn)行自組裝，形成新的晶體。從紅外光譜分析可以看出，β－谷甾醇與γ－谷維素發(fā)生的氫鍵效應(yīng)的強(qiáng)弱隨著兩者的比例而不同，當(dāng)β－谷甾醇和γ－谷維素的比例為2∶3(m/m)，即物質(zhì)的量比為1∶1時，產(chǎn)生的氫鍵效應(yīng)最大，其油相體系在偏振光顯微鏡中呈現(xiàn)出規(guī)則緊密的四瓣形新晶體，硬度也最大。

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