崔飛飛，潘瑩瑩，張 龍，謝浩煌，時洪雪，肖 健，姜麗萍

（溫州醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院，浙江溫州325035）

壓瘡是臨床常見的并發(fā)癥，是皮膚或皮下組織由于壓力，或復(fù)合有剪切力或／和摩擦力作用發(fā)生在骨隆突處的局限性損傷［1］。局部組織缺血、缺氧，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），過強或持續(xù)的ERS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、同源蛋白（homology protein，CHOP）是ERS的特異性蛋白，其可以反映ERS的程度，心、腦等缺血性損傷中已經(jīng)對ERS相關(guān)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞損傷有所報道［2］，但在壓瘡損傷過程中的作用鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠40只（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供），體重320～350 g。大鼠自由飲水、進食，室溫（25±2）℃，分籠喂養(yǎng)。GRP78、CHOP抗體均由 Santa Cruz Biotechnology提供，二抗和內(nèi)參抗體分別由上海碧云天生物技術(shù)研究所和武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 參照王艷艷等［3］的方法制備早期壓瘡動物模型。40只SD大鼠自由飲水，腹腔注射麻醉后，將大鼠俯臥于泡沫床墊上，暴露施壓部位。隨機分為對照組、實驗組分為1個周期組（1 c組）、3個周期組（3 c組）、6個周期組（6 c組）、9個周期組（9 c組）（n＝8），各組體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。1 c組：對兩側(cè)大腿股薄肌施加22.47 kPa壓強，持續(xù)施壓 2 h，放松 0.5 h，即 1個周期；3 c組、6 c組、9 c組：于同一部位施加等同大小的壓強，同樣周期分別重復(fù)3次、6次、9次（一天進行3個周期）；對照組：未施壓力。各組大鼠于實驗終點給予安樂死。

1.2.2 標(biāo)本制備 實驗終點，迅速取受壓中心部位肌肉組織（約500mg），存于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫糜贖E染色、免疫組化和Western blot檢測。

1.2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 組織常規(guī)脫蠟、梯度透明、蘇木精-伊紅染色，用 Nikon（TE2000-U）顯微鏡觀察，NISElements圖像采集軟件采集圖像，觀察壓瘡局部肌肉組織病理學(xué)變化。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法 采用 SABC法，常規(guī)設(shè)立陰性對照。3%H2O2處理后熱修復(fù)抗原，5%BSA封閉，一抗 （1∶100）4℃過夜，生物素化二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下進行定性觀察。

1.2.5 Western blot 取組織各200 mg，加入組織蛋白裂解液，勻漿后，離心取上清，按 Bradford法測量蛋白濃度。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗孵育，4℃過夜。TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，孵育1 h，TBST洗滌。ECL顯色、曝光，常規(guī)方法顯影、定影。以GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件分析系統(tǒng)分析，GRP78、CHOP蛋白含量分別用GRP78／GAPDH、CHOP／GAPDH表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，組間差異采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。

2 結(jié)果

2.1 受壓肌肉組織的病理改變

光鏡下觀察顯示：對照組肌纖維排列緊密，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，骨骼肌橫紋清晰，無明顯的炎性細(xì)胞浸潤；實驗組，受壓肌肉組織逐步出現(xiàn)退化的病理變化，表現(xiàn)為肌纖維排列紊亂、水腫，肌間隙增寬，間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，肌纖維出現(xiàn)溶解、斷裂、壞死碎片、空泡變性、玻璃樣變性等病理改變（圖 1）。

2.2 各組受壓肌肉組織中GRP78、CHOP蛋白表達

2.2.1 GRP78蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示：GRP78免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要位于胞漿，細(xì)胞形態(tài)相對飽滿。GRP78蛋白在對照組中呈低表達，在1 c組表達不明顯，3 c組表達顯著，隨后6 c、9 c組下降（圖2）。

2.2.2 CHOP蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示：其棕黃色顆粒，在胞漿和細(xì)胞核表達，多數(shù)陽性細(xì)胞形態(tài)已經(jīng)發(fā)生改變，胞核呈固縮狀。CHOP蛋白在對照組中呈低表達，在1 c組表達升高，3 c組、6 c組下降，9 c組再次升高（圖3）。

Fig.2 Expression of GRP78 protein in compressed muscles tissue（IHC×200）

2.3 Western blot檢測GRP78、CHOP蛋白在受壓組織中的表達

Western blot結(jié)果表明：與對照組相比，GRP78蛋白1 c組開始表達，3 c組達到高峰（P＜0.05），6 c、9 c組表達下降（P＜0.05）；CHOP蛋白 1 c組升高顯著（P＜0.05），3 c組開始下降（P＜0.05），6 c組下降明顯（P＞0.05），9 c組再次升高（P＜0.05，表 1）。

Fig.3 Expression of CHOP protein in compressed muscles tissue（IHC×200）

Tab.1 Expression of GRP78，CHOP protein in compressed muscles tissue detected by Western blot（OD，±s，n＝3）

Tab.1 Expression of GRP78，CHOP protein in compressed muscles tissue detected by Western blot（OD，±s，n＝3）

GRP78：Glucose regulated protein 78；CHOP：Homology protein；C：Cycle*P＜0.05 vs control group

Group GRP78 protein CHOP protein Con 0.64±0.12 0.58±0.18 1c 1.20±0.34 1.48±0.27*3c 1.59±0.24* 1.03±0.21*6c 1.17±0.28* 0.95±0.30 9c 1.09±0.33* 1.69±0.34*

3 討論

前期研究表明，壓瘡損傷的形成并非急性高壓力所致的，而是由間歇性較低壓力重復(fù)作用所造成的局部組織的不完全性缺血再灌注損傷［4］。此過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）功能發(fā)生紊亂，激活ERS反應(yīng)。GRP78是ERS的敏感標(biāo)記物，CHOP是特異凋亡蛋白。GRP78具有細(xì)胞的保護作用，ERS持續(xù)存在或過強時，激活CHOP蛋白表達，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。但壓瘡局部組織損傷與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙之間的關(guān)系研究較少。

本實驗形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，受壓局部肌肉組織出現(xiàn)逐步退化病理變化，即炎癥細(xì)胞增多、肌間隙增寬、肌纖維出現(xiàn)水腫、溶解、斷裂、空泡化、玻璃樣改變現(xiàn)象，這與臧爽等研究結(jié)果一致。這可認(rèn)為，由于外部施加的壓力誘發(fā)了組織缺血缺氧，當(dāng)恢復(fù)血流灌注時，導(dǎo)致大量的氧自由基生成，同時伴隨鈣離子超載，造成細(xì)胞損傷。

生理狀況下GRP78處于無活性狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生ERS時，可誘導(dǎo)GRP78表達，來結(jié)合未折疊蛋白，減少其在ER腔內(nèi)聚集，當(dāng)ERS持續(xù)存在時，則激活下游的凋亡因子CHOP蛋白。本研究免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示GRP78和CHOP蛋白表達總體呈上升趨勢，其早期表達可能與局部受壓肌組織持續(xù)受壓，導(dǎo)致受壓組織缺血缺氧，產(chǎn)生自由基級聯(lián)反應(yīng)，使ER腔內(nèi)的蛋白氧化修飾有關(guān)；GRP78在3 c表達達高峰而CHOP表達下降，揭示了ER中未折疊或錯誤折疊蛋白大量積聚，觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，加強ER對蛋白的折疊能力，來減輕ER的負(fù)荷壓力，減少細(xì)胞損傷；但隨著循環(huán)次數(shù)增加GRP78表達又下降而CHOP在9 c組表達卻再次升高，提示由于持續(xù)受壓和再灌注損傷的聯(lián)合作用，局部組織缺血缺氧加劇，ER折疊酶或分子伴侶功能異常，導(dǎo)致ERS持續(xù)存在或反應(yīng)過度，使GRP78無法處理ER堆積的錯誤蛋白，且誘導(dǎo)CHOP的表達來處理過度受損的細(xì)胞，以此來恢復(fù)ER內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。李蕊君等報道GRP78在心肌細(xì)胞缺氧0.5 h即開始表達，缺氧1 h達到高峰，之后隨著缺氧時間的延長表達逐漸下降；左群等報道，CHOP的表達表現(xiàn)為運動后呈上升趨勢，1 d時出現(xiàn)第一次高峰，之后略有下降，1周達到高峰，2周時出現(xiàn)下降趨勢，本實驗結(jié)果趨勢與其一致。

綜上所述，ERS參與了壓瘡損傷過程，壓瘡損傷難以愈合的原因可能與ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有關(guān)，但具體的細(xì)胞信號通路，需進一步研究。

【參考文獻】

［1］ Stekelenburg A，Gawlitta D，Bader D L，etal.Deep Tissue Injury：How Deep is Our Understanding［J］.ArchPhysMed Rehabil，2008，89（7）：1410-1413.

［2］ DeGracia D J，Montie H L.Cerebral ischemia and the unfolded protein reasonse［J］.JNeurochem，2004，91（1）：1-8.

［3］ 王艷艷，孫海琴，張純瑜，等.壓瘡早期動物模型制備及評價［J］.護理學(xué)雜志，2010，25（14）：1-5.

［4］ 蔡福滿，姜麗萍，楊曄琴，等.褥瘡不完全性缺血再灌注損傷簡易模型的建立［J］.中國病理生理雜志，2009，25（4）：830-832.

［5］ Oyadomari S，Mori M.Roles of CHOP／GADD153 in endoplasmic reticulum stress［J］.CellDeathDiffer，2004，11（4）：381-389.