何云凌，吳麗穎，黃 欣，趙 彤，丁學(xué)鋒，吳奎武，范 明，朱玲玲

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認(rèn)知科學(xué)研究室，北京100850）

低氧存在于多種生理病理?xiàng)l件下，如生理?xiàng)l件下處于低氧的腦、腎組織或病理?xiàng)l件下低氧造成的腦卒中，心肌梗死等［1，2］。低氧程度決定機(jī)體處于生理或病理環(huán)境之中。在體外，低氧對細(xì)胞存活能力的影響可作為判定低氧程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。反之，不同低氧程度可通過多種信號通路決定細(xì)胞的存活。自噬是細(xì)胞在應(yīng)激，尤其是營養(yǎng)匱乏或低氧后被大量誘導(dǎo)，并通過自噬溶酶體途徑降解細(xì)胞自身不利成分以換取存活的一種有益的代謝途徑［3，4］?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）在細(xì)胞低氧后大量產(chǎn)生，這嚴(yán)重影響了細(xì)胞的存活能力，而自噬可以減少ROS的產(chǎn)生。在本研究中，我們以對低氧敏感的腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞（PC12）為模型，比較了不同低氧程度對細(xì)胞存活的影響，探討了細(xì)胞代謝產(chǎn)物ROS的變化及與自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，胰酶購自Hyclone公司；P62鼠單抗購自Abcam公司；LC3B兔單抗購自 Cell signal technology公司；β-actin鼠單抗購自Sigma公司；活性氧（ROS）探針分子購自Invitrogen公司；3-甲基腺嘌呤（3-MA）購自 Sigma公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞（PC12）為本實(shí)驗(yàn)室保存。根據(jù)我們以往方法［5］，細(xì)胞復(fù)蘇后使用含有5%胎牛血清，10%馬血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，孵育在5%CO2，空氣濕度為95%，溫度37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞接種1 d后用于低氧實(shí)驗(yàn)。

1.3 低氧處理

細(xì)胞傳代并置于常氧培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別轉(zhuǎn)至 10%O2，0.3%O2或 3%O2低氧培養(yǎng)箱（COY laboratory products公司）處理24 h或48 h，常氧（20%O2）對照同時(shí)在常氧培養(yǎng)箱（Forma Scientific公司）中培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活

將細(xì)胞懸液每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板中，終密度為 3×103cells／cm2，1.5×104cells／cm2。在低氧后加入 MTT（Sigma公司，儲液濃度 5.0 g／L）10μl／well，放入培養(yǎng)箱孵育 4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）100μl／well，在酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo公司）上測各孔的吸光度值，檢測波長490 nm。

1.5 Western blot

細(xì)胞低氧后去除培養(yǎng)液，加入裂解液〔50mmol／L Tris（pH 7.4），150 mmol／L NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，1mmol／LDTT，1mmol／L PMSF以及蛋白酶抑制劑Cocktail（Roche公司）等〕，充分裂解細(xì)胞，4℃，12 000 r／min離心15min，保留上清，-80℃貯存?zhèn)溆?，以Bradford法測定總蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離結(jié)束后，取出凝膠濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至同等大小的PVDF膜（Milliphore公司）上，室溫下5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入稀釋后的一抗抗體 LC3B（1∶1 000）、p62（1∶20 000）、β-actin（1∶20 000），4℃孵育過夜，羊抗鼠IgG或羊抗兔 IgG（MBL公司，1∶2 000），室溫孵育2 h，用ECL法顯色，暗室中膠片曝光。

1.6 流式細(xì)胞分析活性氧（ROS）含量

細(xì)胞常氧孵育24 h后，加藥組加入終濃度為1mmol／L的 3-MA，分別轉(zhuǎn)至 10%O2，0.3%O2低氧孵箱培養(yǎng)24 h，低氧后加入終濃度為5μmol／L的活性氧探針分子carboxy-H2DCFDA（Invitrogen公司），避光，37℃孵育30 min，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，細(xì)胞懸浮于 0.01 mol／L PBS中，流式細(xì)胞儀（Beckman公司）進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用 T-test分析。

2 結(jié)果

2.1 不同低氧下的細(xì)胞存活能力

通過MTT實(shí)驗(yàn)，我們比較了不同細(xì)胞接種密度，不同氧含量以及不同低氧時(shí)間對細(xì)胞存活能力的影響。結(jié)果表明（圖1），低氧24 h，無論較低或較高接種密度，0.3%O2都降低了細(xì)胞存活能力，低氧48 h后降低得更為明顯：分別下降了42.23%±4.82%（P＜0.01）和 44.61% ±4.86% （P＜0.01）；在較低的接種密度下，細(xì)胞經(jīng) 10%O2處理24 h和48 h后存活能力都顯著增加：分別增加了20.04%±4.46% （P＜0.01）和 12.64% ±2.82%（P＜0.01）。因此，我們選擇了該細(xì)胞接種密度，并選取0.3%O2（定義為嚴(yán)重低氧）和10%O2（定義為適度低氧）這兩種氧含量作為后續(xù)的低氧處理?xiàng)l件，以比較他們對細(xì)胞的不同作用效果和機(jī)制。

Fig.1 Effectsof differentseeding densities，oxygen contents，and periods on cell survival

2.2 不同低氧對自噬發(fā)生的影響

LC3蛋白在正常情況下以LC3-I的形式存在于胞漿中，在自噬發(fā)生的時(shí)候被切割和脂化成LC3-II后，組裝入自噬前體膜。LC3-II與自噬前體和自噬體的內(nèi)外膜特異結(jié)合，且一直結(jié)合到自噬體與溶酶體融合，因此LC3-II目前被公認(rèn)為是自噬的生物學(xué)標(biāo)記物［6］。p62蛋白是一種接頭蛋白，它可作為自噬受體與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合，同時(shí)與自噬體膜蛋白LC3-II相互作用，從而能夠把泛素化的蛋白質(zhì)運(yùn)送到自噬體內(nèi)降解［7］。p62因此也被視為自噬過程中的一個必要蛋白。不同低氧處理后，通過Western blot檢測我們發(fā)現(xiàn)，與常氧對照相比，適度低氧提高了LC3-II和p62蛋白的表達(dá)，嚴(yán)重低氧則降低了其表達(dá)（圖2）。該結(jié)果表明，適度低氧能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，嚴(yán)重低氧對自噬起到了抑制作用。

Fig.2 Autophagy under differenthypoxia

2.3 不同低氧下的活性氧水平及自噬的介導(dǎo)作用

活性氧（ROS）水平反應(yīng)了細(xì)胞的一種氧化損傷程度。細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生的ROS可以被自由基清除系統(tǒng)所去除，并且也可以作為一種信號分子激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路。當(dāng)ROS大量產(chǎn)生時(shí)，其氧化程度超出其被清除作用，就會引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的氧化損傷［8］。在本研究中，我們采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了ROS水平的變化。PC12細(xì)胞經(jīng)過適度低氧處理后，ROS水平?jīng)]有明顯改變，但嚴(yán)重低氧導(dǎo)致ROS水平明顯增加；經(jīng)自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，常氧組細(xì)胞的ROS水平有所增加，但增加幅度不明顯，適度低氧和嚴(yán)重低氧組細(xì)胞中的ROS水平都顯現(xiàn)增加趨勢，且增加幅度顯著（圖3見彩圖頁Ⅰ）。該結(jié)果提示，在這三種氧條件下都有自噬的發(fā)生，然而適度低氧和嚴(yán)重低氧過程中自噬被更多量的誘導(dǎo)，這可能導(dǎo)致了ROS水平的差異，并最終影響了細(xì)胞在不同低氧下的存活。

Fig. 3 Levels of ROS under different hypoxia analyzed by flow cytometry

3 討論

不同程度低氧對細(xì)胞存活的影響，取決于氧含量和低氧持續(xù)時(shí)間。通過接種不同細(xì)胞密度，我們比較了不同氧含量以及不同低氧時(shí)間對細(xì)胞存活能力的影響。結(jié)果顯示，與常氧組相比，在較低接種密度下低氧24 h和48 h后，10%O2都促進(jìn)了細(xì)胞存活，而0.3%O2則導(dǎo)致細(xì)胞存活能力下降。為此，根據(jù)低氧程度對細(xì)胞存活的不同效用，我們分別定義為適度低氧和嚴(yán)重低氧。

那么，適度低氧如何使細(xì)胞存活能力增加，而嚴(yán)重低氧如何導(dǎo)致細(xì)胞存活能力降低的呢？我們知道，在常氧情況下，細(xì)胞代謝處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，如果打破了這種平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境則容易發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞存活能力降低。在低氧情況下，細(xì)胞代謝易發(fā)生異常，最常見的是由于缺氧而導(dǎo)致線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過量的活性氧（ROS），ROS如果得不到及時(shí)清除，就會攻擊細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類、DNA等生物大分子，造成細(xì)胞損傷。自噬是近年被熱衷研究的一種生物現(xiàn)象，以往研究多集中于細(xì)胞的自噬性死亡，新近發(fā)現(xiàn)自噬在幫助細(xì)胞度過饑餓等應(yīng)激時(shí)具有保護(hù)性作用。自噬不僅可以清除老化的、錯誤折疊的蛋白，也可以清除受損的細(xì)胞器（如線粒體），同時(shí)，自噬的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)又可為細(xì)胞提供一定的能量和合成底物［9］。在自噬過程中ROS將通過對受損線粒體的降解而被減少［10］。因此，低氧過程中如果自噬被誘導(dǎo)并有效減少了ROS水平，那么將有利于細(xì)胞存活，反之，則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

LC3-II和p62分別是自噬標(biāo)記分子和自噬連接分子，通過對其水平的檢測，我們發(fā)現(xiàn)適度低氧使LC3-II和p62表達(dá)升高，表明適度低氧誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生；嚴(yán)重低氧下LC3-II和p62表達(dá)降低，意味著自噬的發(fā)生受到了抑制。為進(jìn)一步驗(yàn)證自噬是否介導(dǎo)了不同低氧對ROS的影響，我們采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了抑制自噬前后細(xì)胞中的ROS水平。結(jié)果顯示，適度低氧沒有改變ROS含量，但抑制自噬后ROS含量增加，表明自噬介導(dǎo)了適度低氧下的ROS水平；嚴(yán)重低氧下ROS含量明顯增加，抑制自噬后ROS含量繼續(xù)增加，表明嚴(yán)重低氧下也有自噬的發(fā)生，但其自噬的發(fā)生不足以減少ROS水平。我們由此推測嚴(yán)重低氧導(dǎo)致了線粒體受損，而受損線粒體的自噬過程受到一定程度抑制，因而引發(fā)ROS水平升高，并最終使細(xì)胞存活減少。我們將在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中對線粒體自噬進(jìn)行檢測，以明確該機(jī)制。

總之，通過本研究我們證實(shí)了不同低氧條件對細(xì)胞存活能力的影響，以及自噬在其中所起的介導(dǎo)作用?？梢?，自噬是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的一種主動性調(diào)節(jié)過程，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生將有助于抵御低氧損傷。

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