任培土，傅 宏

論著

Cyclin E和p53在膽囊癌組織中的表達(dá)及意義

任培土，傅 宏

目的:探討p53和細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）在膽囊癌組織中的表達(dá)及其意義。方法:采用免疫組化方法，檢測(cè)p53和Cyclin E在膽囊癌組織中的表達(dá)狀況，并以同期慢性膽囊炎組織作為對(duì)照。結(jié)果：p53和Cyclin E在膽囊癌組織中表達(dá)陽性率較慢性膽囊炎組高，在中-低分化膽囊癌組織中表達(dá)陽性率較高分化膽囊癌組織高，與腫瘤有無淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤1年生存率無明顯相關(guān)性；Cyclin E在晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中表達(dá)陽性率較早期（Nevin I～I(xiàn)I期）膽囊癌組織高,Cyclin E表達(dá)陽性的膽囊癌患者1年生存率較表達(dá)陰性者低（P＜0.05）。結(jié)論:檢測(cè)分析p53和Cyclin E在膽囊組織中的表達(dá)，有助于對(duì)膽囊癌進(jìn)行早期診斷和判斷預(yù)后。

p53；細(xì)胞周期蛋白E；膽囊癌；免疫組織化學(xué)

膽囊癌發(fā)現(xiàn)晚，預(yù)后差，治療效果不佳。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們的認(rèn)識(shí)從解剖學(xué)的整體水平，擴(kuò)展到以細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)胞水平、核酸和蛋白質(zhì)水平上。本研究通過同時(shí)檢測(cè)p53和細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）在膽囊癌組織中的表達(dá)，為膽囊癌惡性程度和預(yù)后的判斷提供新的思路，進(jìn)而探索有效治療措施。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 隨機(jī)選擇2000年1月—2008年1月膽囊癌患者50例為研究對(duì)象，男21例，女29例；年齡34～81歲，平均64歲。選取同期慢性膽囊炎50例石蠟包埋的組織標(biāo)本作為對(duì)照組，男23例，女27例；年齡32～80歲，平均60歲。準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床診斷為膽囊癌；（2）經(jīng)過手術(shù)，且存有石蠟包埋的組織標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）轉(zhuǎn)移性膽囊癌；（2）合并有其他惡性腫瘤。兩組基本資料比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 p53和Cyclin E表達(dá)的檢測(cè) 采用EnVision TM、TRP/DAB，鼠/兔二步法染色。主要試劑：正常山羊血清購(gòu)自博士德生物工程有限公司，一抗鼠抗人Cyclin E購(gòu)自邁新公司，EnVision TM檢測(cè)試劑盒購(gòu)自基因公司。

結(jié)果判定：p53以鏡下觀察細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。采用雙盲法計(jì)陽性細(xì)胞。染色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：未見褐色著色腫瘤細(xì)胞為（-），腫瘤細(xì)胞染色少于10%為弱陽性（+），10%～50%為中度陽性（++），50%以上為強(qiáng)陽性（+++）。Cyclin E以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為陽性細(xì)胞，Cyclin E染色結(jié)果陰性（-）為陽性細(xì)胞率＜5%，陽性（+）為陽性細(xì)胞率＞5%。

1.3 數(shù)據(jù)收集 收集p53和Cyclin E在不同組織中的表達(dá)，以及膽囊癌的病理類型、腫瘤分化程度、Nevin分期、是否轉(zhuǎn)移以及患者性別、年齡和預(yù)后。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)獲取的數(shù)據(jù)加以匯總，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

兩組病人均檢測(cè)p53和Cyclin E在膽囊癌組織中的表達(dá)。p53在膽囊癌中的表達(dá)如圖1示；Cyclin E在膽囊癌中的表達(dá)如圖2示。

圖1 p53在膽囊癌組織中表達(dá)（×200）

圖2 Cyclin E在膽囊癌組織中表達(dá)（×200）

2.1 p53在膽囊癌和膽囊炎組織中的表達(dá) p53在膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為64%(32/50)，膽囊炎組織中陽性率為2%(1/50)，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。p53在中-低分化膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為78%（29/37），高分化膽囊癌組織中陽性率為23%（3/13），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。p53在早期（Nevin I～I(xiàn)I期）膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為64%（9/14），晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中為64%（23/36），兩者無顯著性差異。p53在有淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為61%（14/23），無轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中為67%（18/27），兩者無顯著性差異。50例膽囊癌中5例失訪。45例中p53陽性組的1年生存率為21%（6/29），p53陰性組為25%（4/16），兩者無顯著性差異。p53在不同病理類型膽囊癌中的表達(dá)因標(biāo)本量較小，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 Cyclin E在膽囊癌和膽囊炎組織中的表達(dá)Cyclin E在膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為42%(21/50)，膽囊炎組織中陽性率為6%(3/50)，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在中-低分化膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為51%（19/37），高分化膽囊癌組織中陽性率為15%（2/13），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在早期（Nevin I～I(xiàn)I期）膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為14%（2/14），晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中為53%（19/36），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在有淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中表達(dá)陽性率為43%（10/23），無轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中為41%（11/27），兩者無顯著性差異。50例膽囊癌5例失訪。45例中Cyclin E陽性組的1年生存率為3%（1/29），Cyclin E陰性組為56%（9/16），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在不同病理類型膽囊癌中的表達(dá)因標(biāo)本量較小，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 討論

膽囊癌的生物學(xué)性質(zhì)非常惡劣，容易發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。加之起病隱匿，膽囊結(jié)石等在癥狀和體征上都對(duì)早期的膽囊癌有所掩飾，大部分膽囊癌在行剖腹探查時(shí)已經(jīng)發(fā)展到進(jìn)展期，手術(shù)往往難以切除，且對(duì)化療、放療不敏感，預(yù)后差，總體治療效果不能令人滿意。盡管近年來影像學(xué)診斷技術(shù)有了明顯進(jìn)步，但因該病的癥狀和體征缺乏特異性，確診時(shí)疾病多屬晚期。突破漿膜的晚期腫瘤，其生物學(xué)進(jìn)程要比早期腫瘤快得多。不同惡性程度的腫瘤病人，其預(yù)后亦不同。因此，在臨床工作中會(huì)有不同的治療目的和思路，進(jìn)而采取不同的治療措施。如何更好地判斷腫瘤的惡性程度和預(yù)后情況，從而為治療措施提供依據(jù)，成為腫瘤工作者的目標(biāo)。近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多種膽囊癌相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)記物如p53、Cyclin E等作了研究，圍繞這些分子標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)、功能和彼此間的相互關(guān)系，來逐漸闡明膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，為基因治療提供理論基礎(chǔ)。

p53基因位于人染色體17p，長(zhǎng)16～20 kb，有11個(gè)外顯子和l0個(gè)內(nèi)含子，編碼53 KD的核蛋白，有轉(zhuǎn)錄因子的特征，控制細(xì)胞的代謝，DNA的修復(fù)和合成，編排細(xì)胞的死亡。p53分為野生型和突變型。由于p53野生型蛋白的半衰期短，利用免疫組織化學(xué)只能檢測(cè)到突變型p53蛋白表達(dá)。p53基因是重要的腫瘤抑制基因，在體內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子，通過活化下游多種基因的表達(dá)，參與DNA損傷修復(fù)，又到細(xì)胞凋亡和分化，調(diào)控細(xì)胞周期和阻止細(xì)胞異常增殖。人類約50%以上的惡性腫瘤均有p53基因的異常改變。研究表明，膽囊癌中有較高頻率p53基因缺失和突變[1]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，p53基因和膽囊癌的增殖、惡性程度和預(yù)后有關(guān)[2-3]。

本研究結(jié)果顯示，膽囊癌組p53蛋白顯著高于膽囊炎組（P＜0.05），提示p53基因突變與膽囊癌變密切相關(guān)，在原發(fā)性膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用。檢測(cè)p53蛋白有助于原發(fā)性膽囊癌的臨床診斷，并可作為膽囊的良性病變與惡性腫瘤相鑒別診斷的一個(gè)輔助指標(biāo)。p53在中-低分化膽囊癌組織中表達(dá)陽性率較高分化膽囊癌組織高，且有顯著性差異。可見p53的表達(dá)水平是判斷腫瘤組織分化程度的一個(gè)重要客觀指標(biāo)，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，p53陽性表達(dá)率越高，從而為判斷腫瘤的惡性程度提供了依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，p53在早期（Nevin I～I(xiàn)I期）膽囊癌組織和晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中，表達(dá)無顯著性差異，與腫瘤有無轉(zhuǎn)移及腫瘤1年生存率無明顯相關(guān)性。提示p53的異常表達(dá)發(fā)生在膽囊癌的早期就存在，并且隨著腫瘤的發(fā)展將持續(xù)存在。因此，檢測(cè)p53的異常表達(dá)，有助于膽囊癌的早期診斷。

細(xì)胞的增殖分裂是細(xì)胞最基本的生理活動(dòng)，細(xì)胞的增殖分化依賴于細(xì)胞有序的周期活動(dòng)。目前已明確，在細(xì)胞周期活動(dòng)中存在調(diào)控點(diǎn)，控制細(xì)胞周期進(jìn)展的速度。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期增殖調(diào)節(jié)失控有密切關(guān)系。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白(cyclin，亦稱之為循環(huán)素)有cyclin A、B、C、D、E、F、G、H等。Cyclin E是一類核蛋白，分子量約5×104，Cyclin E基因定位于19q12～13，有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。Cyclin E在細(xì)胞周期中呈明顯的周期性表達(dá)，正常情況下Cyclin E合成于G1中期，至G1晚期Gl～S交界處含量達(dá)高峰，隨后細(xì)胞進(jìn)入S期。S期內(nèi)Cyclin E經(jīng)與“PEST”序列有關(guān)的蛋白分解或泛素化路徑降解而迅速下降，到G2/M期降為零。目前普遍認(rèn)為G1期Cyclin E是原癌基因。

本研究結(jié)果顯示，Cyclin E在膽囊癌組織中表達(dá)陽性率較膽囊炎組織高，在中-低分化膽囊癌組織中表達(dá)陽性率較高分化膽囊癌組織高，在晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中表達(dá)陽性率較早期（Nevin I～I(xiàn)I期）膽囊癌組織高，Cyclin E表達(dá)陽性者1年生存率較表達(dá)陰性者低，且有顯著性差異?？梢奀yclin E在膽囊癌早期即有表達(dá)，且有Cyclin E陽性率越高腫瘤細(xì)胞分化程度越低、分期越晚、1年生存率越低的趨勢(shì)。Cyclin E的檢測(cè)解決了膽囊癌診治過程中的不少難題，早期表達(dá)有助于早期診斷，而在分化差、晚期和生存率的膽囊癌患者中的高表達(dá)，表明Cyclin E陽性表達(dá)程度高可能提示預(yù)后不良。Cyclin E的過表達(dá)可加速細(xì)胞增殖周期，促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞異常增殖，在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。至于Cyclin E的過表達(dá)機(jī)制，目前尚未清楚。有人認(rèn)為可能是由于DNA擴(kuò)增所致。在沒有基因擴(kuò)增的腫瘤患者中，轉(zhuǎn)錄水平的改變和信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的上調(diào)與Cyclin E過表達(dá)有關(guān)。

本研究表明，p53和Cyclin E的表達(dá)與膽囊組織的良惡性、組織分化程度、膽囊癌的Neivin分期以及預(yù)后有關(guān)。兩項(xiàng)指標(biāo)結(jié)合分析，可更好地對(duì)膽囊癌進(jìn)行早期診斷和判斷預(yù)后。Cyclin E是細(xì)胞周期正性調(diào)控因子，是細(xì)胞進(jìn)人S期的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)基因，而p53出現(xiàn)于細(xì)胞的G1晚期，調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期進(jìn)人S期。p53和Cyclin E的表達(dá)在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，可能通過協(xié)同作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但腫瘤的發(fā)展涉及多種相關(guān)基因的調(diào)控，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活均可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。p53的表達(dá)與Cyclin E的表達(dá)之間是否通過共同途徑進(jìn)而相互影響，其具體機(jī)制仍不十分明確，有待增加病例數(shù)進(jìn)一步研究。

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（收稿：2012-12-26 修回：2013-04-08）

（責(zé)任編輯 孔 棣）

The Expression of p53 and Cyclin E in Gallbladder Carcinoma Tissues

REN Pei-tu,FU Hong Depart?ment of Hepatobiliary Surgery of Shaoxing People’s Hospital,Shaoxing(312000),China

ObjectiveTo explore the expression of p53 and Cyclin E in gallbladder carcinoma tissue and their significance.MethodsThe expression of p53 and Cyciln E in gallbladder carcinoma were detected by immunohistochemical technique and 50 cases of chronic cholecystitis tissues were collected as control.ResultsThe positive expression rate of p53 and Cyclin E was higher in gallbladder carcinoma than that in chronic chole?cystitis tissues.It was also higher in mid-low differerentiated gallbladder carcinoma than that in high differerenti?ated tissues.The expression of p53 had no significant difference between the early stage gallbladder carcinoma (Nevin I and II)and advanced stage(Nevin III-V)in while Cyclin E had.The lymphatic metastasis was not relat?ed with the expression of p53 and Cyclin E.The 1-year survival rate was not related with the expression of p53, but it was higher in patients whose Cyclin E were negative than positive ones.ConclusionAnalysis of expres?sion of p53 and Cyclin E is helpful to the early diagnosis and prognostic indication of gallbladder carcinoma.

p53;Cyclin E;immunohistochemistry;gallbladder carcinoma

R735.8

A

1007-6948(2013)05-0487-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.001

浙江省紹興市人民醫(yī)院，浙江大學(xué)紹興醫(yī)院肝膽外科（紹興 312000）

任培土，E-mail：sxrenpeitU@l63.com