陳興田 陳廣通 汪冬庚 黃金華

[摘要]目的觀察復方金蟾膠囊對小鼠移植性肝癌HepA腹水瘤的抑制作用。方法將50只BALB/C小鼠隨機分為模型組、對照組（環(huán)磷酰胺，CTX）、金蟾小劑量組、金蟾中劑量組和金蟾大劑量組，每組10只。采用移植性HepA肝癌腹水瘤模型，進行抑制腫瘤的實驗；給藥結(jié)束第3天，摘取小鼠腫瘤組織和胸腺組織計算抑瘤率和胸腺指數(shù)，用流式細胞儀觀察腫瘤細胞周期及細胞凋亡情況；取血測定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。結(jié)果與模型組比較，金蟾各劑量組均可以增加小鼠胸腺重量及胸腺指數(shù)（P<0.01），明顯抑制腫瘤生長；與模型組比較，對照組的腫瘤細胞僅G2/M期比例增加（P<0.05），金蟾小劑量組僅S期細胞比例增高（P<0.05）；金蟾大劑量組G2/M期、S期細胞比例均高于模型組。結(jié)論復方金蟾膠囊對小鼠移植性HepA肝癌腹水瘤具有明顯抑制作用。

[關鍵詞]肝癌；BALB/C小鼠；環(huán)磷酰胺；金蟾膠囊

[中圖分類號]R735.7 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-4721（2012）12（a）-0012-03

隨著工業(yè)化的進展的加速，各種污染就隨之而來，癌癥的發(fā)生率也逐步上升。在長江和黃海的交界的啟海農(nóng)村，肝癌成為最常見的惡性腫瘤。為此，國家專門設立江蘇省啟東肝癌研究所，以研究肝癌的起因、預防和治療。目前治療肝癌的方法很多，效果均不明顯，尤其是晚期肝癌，生存期很難延長。開發(fā)傳統(tǒng)中草藥用來抗癌是當今腫瘤防治的趨勢之一。蟾蜍是指兩棲綱蟾蜍科動物中華大蟾蜍，多產(chǎn)于江浙一帶，以蟾蜍為來源的中藥材有蟾酥、蟾皮、干蟾，主要藥用作用有強心、解毒、止痛、增強免疫等。其本身就有一定毒性，食用過量會導致死亡。所以，古代中醫(yī)就有“以毒攻毒”的說法，用它來治療惡性疾病。目前發(fā)現(xiàn)蟾蜍具有一定抗腫瘤的作用，啟東肝癌研究所生產(chǎn)的復方蟾龍片，海門的蟾衣研究所生產(chǎn)的蟾衣制品，均為開發(fā)的蟾蜍產(chǎn)品，在臨床抗肝癌治療中，都取得了一定的效果。金蟾膠囊是本院自行開發(fā)研制，以中華大蟾蜍的新鮮蟾皮為主藥，配以其他十幾味珍貴中藥精制而成的中藥復方制劑。本研究復制肝癌模型，施以金蟾膠囊治療，觀察驗證其抗腫瘤作用并探討其作用機制，為該復方中藥的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

BALB/C小鼠50只，均為雄性，體重20～25g，由南通大學醫(yī)學動物實驗中心提供，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2002—0022。瘤株采用HepA肝癌腹水瘤小白鼠，種鼠由中國科學院上海藥物研究所提供。

1.2儀器與試藥

1.2.1儀器 流式細胞儀：美國guavaeasyCyte8系統(tǒng)；分析天平：梅特勒-托利多-30型；凈化臺：蘇州凈化設備公司SW-CJ-2F型。

1.2.2試藥 金蟾膠囊：每粒含中藥0.25g，由南通大學藥學院加工制備，批號：20110408；實驗前將膠囊內(nèi)容物用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）水溶液調(diào)配成3種不同濃度的混懸液，備用。環(huán)磷酰胺（CTX）：無錫恒瑞制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：110211，實驗時用注射用蒸餾水溶解配制。

1.3方法

取出HepA肝癌腹水瘤小白鼠的腹水瘤，搗碎成溶液。吸取0.2mL用16號針尖腹腔接種到BALB/C小鼠的腹內(nèi)，一共接種50只，第2天稱重，隨機分為5組。（1）模型對照組：10只小鼠，用0.5%CMC溶液灌胃，劑量為1mL/100g小白鼠體重；（2）陽性對照組：10只小鼠，腹腔注射CTX，劑量為2mg/100g體重；（3）金蟾小劑量組：10只小鼠，用金蟾膠囊混懸液灌胃，劑量為40mg/100g體重；（4）金蟾中劑量組：10只小鼠，用金蟾膠囊混懸液灌胃，劑量為80mg/100g體重；（5）金蟾大劑量組：10只小鼠，用復方金蟾膠囊混懸液灌胃，劑量為120mg/100g。各組按照上述要求給藥，每天1次，連續(xù)10d，到第11天處死。

1.4觀察指標

1.4.1抑瘤率和胸腺指數(shù) 剝離皮下瘤塊，用濾紙吸干凈后稱重，計算各組抑瘤率和胸腺指數(shù)。計算公式為胸腺指數(shù)=[胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠質(zhì)量（g）]×10。抑瘤率=（對照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重[1-2]。

1.4.2小鼠TNF-a濃度測定 在實驗到第11天小鼠處死前，各組采用眼球摘取法取血1mL，放置于冰箱0℃保存，24h后，于1500r/min離15min，取上清液，用波長450nm酶聯(lián)儀依序測量光密度（OD值）后換算血清中TNF-α濃度[3-4]。

1.4.3金蟾膠囊對HepA肝癌腹水瘤細胞周期測定 各組小鼠處死后，立即打開腹部，剝離腹部腫瘤組織，放入少許磷酸鹽緩沖液，將腫瘤組織用手術剪剪至漿糊狀，再用200目尼龍篩過濾。然后將濾液用緩沖液PBS沖洗3次，沖完后用600r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，除去大的細胞碎片。每根試管中加入70%乙醇1mL，用于固定細胞，然后放置于低溫冰箱-20℃凍存，24h后溶解，離心去除乙醇，再用緩沖液PBS沖洗2次。加入混合溶液1mL（含0.1%檸檬酸三鈉、0.3%TritonX-100、RNA酶、0.002%、0.01%PI，用0.9%氯化鈉溶液配制），10min后用200目尼龍篩過濾，取濾液上機檢測細胞周期[5-7]。

1.5統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學處理采用Stata7.0統(tǒng)計軟件進行分析 各組資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組的抑瘤率和胸腺指數(shù)比較

實驗結(jié)果表示，與模型對照組比較，復方金蟾膠囊各組小鼠平均腫瘤組織的重量均有明顯降低，其中，大劑量組與其他兩組比較，對HepA肝癌腹水瘤有更顯著的抑制作用（P<0.01），胸腺指數(shù)也顯著增高（P<0.01），并隨著劑量的遞增，抑瘤作用逐漸增強，顯示出有較好的量-效關系。見表1。

2.2血清TNF-α濃度的測定

與模型對照組之間比較，3個藥物治療組的血清TNF-α濃度均明顯降低（P<0.05）；而各治療組之間互相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表2。

2.3金蟾膠囊對瘤細胞分裂各期的影響

復方金蟾膠囊各劑量組均能提高腫瘤細胞G0～G1期比例，減小S期比例，進而促進瘤細胞凋亡，其作用強度的變化呈劑量依賴性。金蟾膠囊各組對腫瘤細胞G2～M期的影響不大。結(jié)果見表3。

3討論

復方金蟾膠囊是由蟾皮、東北虎骨草、藏雪蓮、蝎子等珍貴中藥精致提煉而成。為驗證其臨床抗癌效果，本研究通過復制移植HepA肝癌腹水瘤小鼠的建立模型，進行抗腫瘤實驗研究。結(jié)果表明，復方金蟾膠囊對HepA肝癌腹水瘤生長具有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴性，其可能在誘導細胞分化、促進細胞凋亡、抑制血管生成、改變腫瘤細胞相關基因的表達等方面發(fā)揮抗腫瘤的作用。

血清中的TNF-α能嚴重破壞細胞因子間正向的協(xié)調(diào)作用，使細胞因子網(wǎng)絡功能紊亂，造成血管滲漏、脂肪降解等病理損傷。而在實體瘤小鼠體內(nèi)的TNF-α會異常升高[8-12]。本實驗結(jié)果表明：金蟾膠囊能顯著降低HepA肝癌腹水瘤小鼠TNF-α濃度，增加小鼠胸腺重量及胸腺指數(shù)，對于TNF-α水平異常升高的HepA肝癌腹水瘤小鼠起到明顯的抑制作用，并控制在一個低水平狀態(tài)，說明其是通過提高機體免疫作用來發(fā)揮其抗腫瘤療效的。

實驗中應用流式細胞儀檢測各組小鼠HepA肝癌腹水瘤的細胞周期各時相分布，發(fā)現(xiàn)在復方金蟾膠囊的藥物作用下的小鼠肝癌H22細胞細胞周期時相發(fā)生變化，使細胞增殖周期受阻，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡；其S期細胞百分比明顯減少，差異極顯著；表明復方金蟾膠囊能明顯阻滯肝癌H22細胞由G1期進入S期，使其停滯于G1/G0期，從而減少細胞在該期DNA的復制和合成，進而達到抑制腫瘤細胞生長的目的。

總之，金蟾膠囊抗腫瘤作用確切，可以進一步研究開發(fā)利用。

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（收稿日期：2012-09-13 本文編輯：陳 ?。?/p>