■竇茂鑫 趙 迪 侯永清 吳 濤

（動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

長(zhǎng)期以來(lái)，飼料中添加抗生素為集約化畜牧業(yè)的發(fā)展做出重大貢獻(xiàn)的同時(shí)也帶來(lái)了諸多負(fù)面影響，如容易造成仔豬的抗藥性、毒副作用和體內(nèi)殘留及環(huán)境污染等[1]。新型藥物添加劑牛至油，以其綠色、環(huán)保、廣譜抗菌、促生長(zhǎng)、無(wú)殘留及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在未來(lái)養(yǎng)豬業(yè)上的應(yīng)用前景非常看好[2]。本研究建立了飼料藥物添加劑牛至油中香芹酚和百里香酚的檢測(cè)方法，本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、選擇性好，為牛至油的檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（Waters 1525型，配Waters 2489檢測(cè)器）、超聲波清洗器、電子天平（精度0.000 1 g）。

1.2 試驗(yàn)試劑

甲醇、冰醋酸為色譜純，試驗(yàn)用超純水；香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度≥99%），百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度≥99%）。

1.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(2)柱(粒度為5 μm，柱規(guī)格為250 mm×4.5 mm)，流動(dòng)相：甲醇∶水∶冰醋酸=60∶4∶2，檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣體積為20 μl，柱溫30 ℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密量取香芹酚0.5 ml，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成香芹酚含量為1%的貯備液；精密稱取百里香酚0.5 g，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10 mg/ml的百里香酚貯備液。然后用甲醇將香芹酚貯備液稀釋成含量分別為（×10-3μl/ml）5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0的標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇將百里香酚貯備液稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.5 樣品溶液的制備

精密量取牛至油樣品0.5 ml置于250 ml容量瓶中，加200 ml甲醇超聲提取30 min，冷卻后用甲醇定容，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后制供試樣品溶液。

1.6 加樣回收試驗(yàn)

精密量取5份已知含量的牛至油供試樣品，分別添加已知含量的香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定兩者的回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。圖1表明，香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對(duì)稱，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

圖1 香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

將香芹酚和百里香酚一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別取20 μl進(jìn)樣，測(cè)定積分值，以峰面積為縱坐標(biāo)，分別以香芹酚和百里香酚含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

香芹酚：Y=15 123X+22 670 R2=0.999 8；

百里香酚：Y=14 825X-15 883 R2=0.999 4。

結(jié)果表明，香芹酚在5.0～500.0×10-3μl/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，百里香酚在1～500 μg/ml的濃度范圍內(nèi)也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

分別取0.1 μl/ml的香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和100 μg/ml的百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液 20 μl進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積如表1所示。求得香芹酚和百里香酚峰面積的RSD分別為0.39%和0.82%，說(shuō)明此方法具有較好的精密度。

表1 香芹酚和百里香酚精密度試驗(yàn)（峰面積）

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

牛至油制成的5份牛至油供試樣品中香芹酚含量和百里香酚含量如表2、表3所示。試驗(yàn)測(cè)得香芹酚和百里香酚的平均含量分別為37.81%、7.05 mg/ml，變異系數(shù)分別為0.91%、1.1%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。

表2 牛至油中香芹酚含量測(cè)定試驗(yàn)

表3 牛至油中百里香酚含量測(cè)定試驗(yàn)

2.5 加樣回收試驗(yàn)

精密量取5份已知含量的牛至油供試樣品5 ml，分別置于5個(gè)50 ml容量瓶中，然后分別添加濃度為0.1 μl/ml的香芹酚標(biāo)準(zhǔn)液和50 μg/ml的百里香酚標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)得結(jié)果如表4、表5所示。香芹酚和百里香酚的平均回收率分別為98.2%、98.4%，RSD分別為1.0%、1.3%，結(jié)果說(shuō)明該方法的回收率高。

表4 牛至油中香芹酚回收率測(cè)定試驗(yàn)

表5 牛至油中百里香酚回收率測(cè)定試驗(yàn)

3 討論

牛至油具有抗菌、殺菌功能，因其具有較強(qiáng)的脂溶性和表面活性，與病原微生物的細(xì)胞膜有很強(qiáng)的親和力，能使細(xì)胞膜的通透性增加，內(nèi)容物流失從而殺滅病原微生物[3]。有研究報(bào)道[4-6]，牛至油的主要成分為香芹酚、百里香酚、對(duì)聚傘花素等，其中香芹酚和百里香酚抗菌活性最高。本研究建立了飼料藥物添加劑牛至油中香芹酚和百里香酚的檢測(cè)方法，本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、選擇性好，可作為控制牛至油質(zhì)量的方法。

本試驗(yàn)選用甲醇超聲提取30 min，采用Di?amonsil C18(2)柱分離，Waters 2489檢測(cè)器檢測(cè)，以甲醇-水-冰醋酸（60∶4∶2）為流動(dòng)相，結(jié)果顯示此方法使香芹酚和百里香酚得到很好的基線分離，且重復(fù)性好、回收率高，可以作為牛至油中香芹酚和百里香酚檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。