■ 王 雄程宗佳王彥斐王 麗王 江

（1.北京中檢維康技術有限公司，北京 100044；2.中糧營養(yǎng)健康研究院動物營養(yǎng)與飼料中心，北京 100020）

嘔吐毒素又稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，屬單端孢霉烯族化合物。1973年Yoshizawa首先分離得到了這種化合物，并命名為4-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，同年Vesonder等從污染鐮刀菌并導致美國母豬拒食和嘔吐的玉米中分離得到同樣的化合物，將其命名為嘔吐毒素。嘔吐毒素主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產生，容易對豬產生毒性，對人產生食物中毒性白細胞缺乏癥。動物飼料中嘔吐毒素的中毒癥狀表現(xiàn)為：厭食、嘔吐、消化道發(fā)炎、白血球下降、白尿、運動失調、內臟出血、中樞神經系統(tǒng)細胞變質，具有較強的細胞毒性，對血液及皮膚組織具有損害作用，細胞生長上表現(xiàn)出抑制蛋白質合成和DNA合成的作用[1]。歐盟規(guī)定豬飼料中的嘔吐毒素不得超過0.5 mg/kg,美國的規(guī)定是不得超過1 mg/kg，中國標準規(guī)定豬、犢牛和泌乳期動物配合飼料中嘔吐毒素不得超過1 mg/kg[2]，中國農業(yè)部標準規(guī)定玉米干全酒糟（DDGS）中嘔吐毒素也是不得超過1 mg/kg[3]。我國飼料及飼料原料中嘔吐毒素污染非常嚴重[4-10]，最高值為32.9 mg/kg，為了保護動物健康和食品安全，需要加強對飼料產品中嘔吐毒素的檢測與控制。

目前測定嘔吐毒素常用的檢測方法有薄層色譜法[11]、酶聯(lián)免疫法[12]和親和柱凈化-高效液相色譜法[13]。但這些分析方法需要大型的儀器設備、操作過程復雜、時間長，無法在現(xiàn)場和基礎中小型實驗室使用。近年來膠體金免疫層析技術在真菌毒素快速檢測中得到應用[14-15]，但主要以定性檢測為主[15-17]，存在顯色模糊，人為判斷有誤差，假陽性假陰性比例高等問題。本文建立并驗證了膠體金免疫層析法快速定量檢測飼料中嘔吐毒素的分析方法。

1 試驗材料和方法

1.1 試劑和材料

除注明外,試劑均為分析純,試驗用水均為超純水。

iCheck嘔吐毒素定量快檢卡（CS105，美國CLOVER）由包被有金標記嘔吐毒素抗體的微孔、噴涂有嘔吐毒素抗原檢測線、鼠二抗控制線的測試卡和稀釋緩沖液組成。稀釋緩沖溶液：CSB-2，美國CLOVER。乙腈：色譜純，美國JT BAKER公司。1.5 μm玻璃纖維濾紙：英國WHATMAN公司。嘔吐毒素標準溶液：200 μg/ml，美國SUPLCO公司。嘔吐毒素免疫親和柱：IAC111，美國CLOVER公司。飼料樣品：玉米、玉米酒糟、麥麩、豬飼料、雞飼料。

1.2 儀器與設備

iCheck食品安全定量快檢儀：Ⅱ型，美國CLOVER；通過對檢測線和控制線的顏色分析而進行定量檢測。高效液相色譜儀配紫外檢測器：型號L-10A，為島津公司產品。

液相色譜工作條件：①色譜分析柱：Cloversil ODS-C18柱,5 μm,4.6×250 mm；②流動相：乙腈+水(10+90，V/V)；③流速：0.8 ml/min；④進樣量：20 μl；⑤柱溫:25℃；⑥紫外檢測波長：218 nm。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取

取50～250 g樣品粉碎，過20目篩，稱取5.0 g磨細樣品加入到50 ml離心管中，再添加25 ml純水，用多功能旋轉混合器混合5 min(或者人工用手劇烈振蕩3 min，或用高速均質器均質1～2 min)，用中速定性濾紙過濾，收集全部濾液。

1.3.2 免疫層析法快速定量檢測

取濾液120 μl于抗體微孔中，加入30 μl稀釋緩沖液，用移液器吸打8次混勻，取100 μl加入到快檢卡樣品孔中。37℃溫育10 min后，將快檢卡插入定量快檢儀中讀數，即為樣品實際濃度。該方法的定量檢測限為500 μg/kg，檢測范圍為0～5 000 μg/kg。讀數值為500 μg/kg時，說明測定結果等于或大于500 μg/kg，如果需要進一步獲得定量的檢測結果，需要將樣品提取濾液用純水按一定比例稀釋，然后進行檢測，稀釋倍數乘以儀器讀數即為檢測結果。

1.3.3 免疫親和柱凈化-HPLC法檢測

粗過濾濾液用玻璃纖維濾紙再過濾，移取濾液2.0 ml過CLOVER嘔吐毒素免疫親和柱，調節(jié)流速約1～2滴/s，直至空氣完全通過免疫親和柱。分別用5 ml的純水以約2～3滴/s清洗免疫親和柱2次，直至空氣完全通過免疫親和柱。加入1.0 ml甲醇，調節(jié)流速約1～2滴/s的流速將免疫親和柱中的嘔吐毒素淋洗下來，用氮氣將洗脫液吹干，加入0.3 ml流動相，混勻后20 μl注入液相色譜分析。

2 結果和討論

2.1 免疫層析快速定量法準確性和重復性的試驗結果

在空白樣品中分別添加嘔吐毒素為500、1 000、5 000 μg/kg濃度水平，然后按照免疫層析法快速定量檢測（見1.3.2），其檢測結果見表1。

表1 免疫層析快速定量法準確性和重復性的試驗結果

從表1中回收率及精密度數據可以看出，本方法嘔吐毒素回收率為75.7%～96.1%之間，室內3個水平添加5次重復的相對標準偏差在19.5%以內。

2.2 免疫層析快速定量法檢出限和定量限的測定

取玉米、玉米酒糟、麥麩、豬飼料、雞飼料5類樣品用免疫親和柱凈化-HPLC法測定不含有嘔吐毒素的空白樣品各10份，用免疫層析法快速定量檢測，結果見表2。我們定義空白樣品測定平均值加3倍標準偏差SD為方法檢出限(LOD)，測定平均值加10倍標準偏差SD為方法定量限(LOQ)。

通過對5類共50個空白樣品中嘔吐毒素的檢測，可以確定免疫層析快速定量法測定嘔吐毒素的檢出限為200 μg/kg，定量限為500 μg/kg。

2.3 與免疫親和柱凈化-HPLC方法的對比試驗結果

10個陽性樣品，應用免疫親和柱凈化-HPLC法和免疫層析快速定量法分別進行檢測（見1.3），其測定結果見表3。

表2 免疫層析快速定量法測定空白樣品的試驗結果(μg/kg)

表3 陽性樣品的試驗結果

表3中相對偏差的計算是以免疫親和柱凈化-HPLC法測定值為參考值，免疫層析法測定結果的最大相對偏差為17.3%，兩組測定結果之間的相關系數為0.98，說明其相關性顯著。

3 結論

膠體金免疫層析快速定量法測定飼料及飼料原料中的嘔吐毒素，方法的檢出限為200 μg/kg，定量限為500 μg/kg，相對標準偏差低于19.5%，回收率為75.7%～96.1%，其準確性和可靠性均可以滿足歐盟[18]和中國[19]對嘔吐毒素分析方法標準的技術要求：回收率70%～110%，CV小于20%。分析一個樣品的時間為20 min內，與免疫親和柱凈化-HPLC法的相關性好。該方法簡便快速、準確可靠、重復性好，可用于對飼料及飼料原料中嘔吐毒素進行快速定量篩查檢測。