■盧 琳
(新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所,新疆烏魯木齊 830063)
L-賴氨酸硫酸鹽(L-Lysine sulphate),其化學(xué)名稱為左旋-2,6-二氨基己酸單硫酸鹽,是一種白色或近白色自由流動(dòng)的結(jié)晶性粉末,幾乎無臭,易溶于水和甲酸,難溶于乙醇和乙醚。其用途主要用作飼料添加劑、食品強(qiáng)化劑和制藥。
賴氨酸是蛋白質(zhì)的重要組分之一,是人體8種必需氨基酸之一,是一種優(yōu)良的食品強(qiáng)化劑。因食物中缺乏賴氨酸,所以又稱“第一必需氨基酸”。將賴氨酸添加到飲品、大米、面粉、罐頭等食品中可以提高蛋白質(zhì)的利用率,從而大大強(qiáng)化食品的營養(yǎng),起到促進(jìn)生長發(fā)育、增加食欲、減少疾病、增強(qiáng)體質(zhì)的作用,用于罐頭中起除臭保鮮的作用。
L-賴氨酸硫酸鹽除含有51%的賴氨酸(相當(dāng)于65%的飼料級(jí)L-賴氨酸硫酸鹽)外,還含有不少于15%的其它氨基酸,可為動(dòng)物提供更為全面、均衡的營養(yǎng),同時(shí)這些氨基酸共同作用還可以提高斷奶仔豬的消化性能,從而使其消化率提高。
高效液相色譜儀(Agilent1200)、METTLER AE240型電子天平(梅特勒公司)。
硼酸鹽緩沖液(borate buffer)(Agilent公司)、鄰苯二甲醛(OPA)(Agilent公司)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)(Agilent公司)、正纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)、L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)、L-賴氨酸硫酸鹽樣品(由新疆梅花氨基酸有限責(zé)任公司提供)。
色譜柱Hypersil AA-ODS 200 mm×2.1 mm,5 μm(Agilent公司);以流動(dòng)相A{(1.36±0.025)g三水合乙酸鈉+500 ml水+90 μl三乙胺[1%~2%乙酸調(diào)節(jié)pH值至(7.20±0.05)]+1.5 ml四氫呋喃}和流動(dòng)相 B{(1.36±0.025)g三水合乙酸鈉+100 ml水[1%~2%乙酸調(diào)節(jié)pH值至(7.20±0.05)]+200 ml甲醇+200 ml乙腈}按表1中的洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.45 ml/min;進(jìn)樣按表2中的進(jìn)樣程序進(jìn)樣;采用紫外檢測器,檢測波長在0~16 min為338 nm、在16~25 min為262 nm;柱溫40 ℃。
表1 洗脫程序
表2 進(jìn)樣程序
2.2.1 樣品溶液制備
稱取250 mg樣品放入100 ml容量瓶中,加1 N鹽酸使之溶解后,放入60~70℃水浴或者超聲波浴中攪拌30 min,變成懸濁液之后常溫冷卻,再用1 N鹽酸定容至100 ml,搖勻。取5 ml此溶液放入50 ml容量瓶中,準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml,用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml,搖勻,用0.22 μm微過濾膜過濾之后檢測。
2.2.2 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)工作液制備
準(zhǔn)確稱量250 mg L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品放入100 ml容量瓶中,加1 N鹽酸,溶解后定容至刻度。分別取1、2、3、4、5 ml此溶液放入50 ml容量瓶中,準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml,用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml,充分搖勻,用0.22 μm微過濾膜過濾之后上機(jī)檢測。
取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)工作液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測定,以含量(x,mg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),得回歸方程:y=5 058.057 14x+15.242 857,r=0.999 6。L-賴氨酸硫酸鹽在0~0.25 mg/ml范圍內(nèi),其含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系(見圖1)。
圖1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液校正曲線
分別取對(duì)照品溶液與樣品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件測定。對(duì)照品與樣品的色譜圖見圖2。圖2中樣品的色譜圖表明,樣品的保留時(shí)間與對(duì)照品的保留時(shí)間一致,樣品峰的峰形清晰,由此,該方法能夠較好地測定飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的含量。
圖2 HPLC色譜圖
2.5.1 對(duì)照品溶液制備
準(zhǔn)確稱量250 mg L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 ml容量瓶中,加1 N鹽酸,溶解后定容至刻度。精確量取5 ml此溶液置于50 ml容量瓶中,準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml,用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml,充分搖勻。
2.5.2 添加樣品溶液制備
分別精密稱取樣品200、250、300 mg置100 ml量瓶中,加1 N鹽酸使之溶解后,放入60~70℃水浴或者超聲波浴中攪拌30 min,變成懸濁液之后常溫冷卻,再用1 N鹽酸定容至100 ml,搖勻。取5 ml此溶液放入50 ml容量瓶中,準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml,用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml,搖勻(結(jié)果見表3)。由表3的回收率測定結(jié)果可見,該方法回收率較高,可以有效地控制飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的質(zhì)量。
表3 回收率測定結(jié)果(%)
本文采用高效液相色譜法,對(duì)飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的含量進(jìn)行定量測定,樣品前處理方法簡單;同時(shí),該方法使用正纈氨酸作為內(nèi)標(biāo)物用以校正,可完全排除被測樣品中其他組分的干擾。該方法的重現(xiàn)性好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可有效地檢測飼料中飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的含量,從而更好地控制市場上流通的飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的質(zhì)量。