■ 馬珊珊 石慧芹馬秋剛 計 成 段國香 張建云 鄭文革

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河南億萬中元生物技術(shù)有限公司，河南鄭州 451191）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）又稱F-2毒素，是由鐮孢菌屬真菌產(chǎn)生的非類固醇類真菌毒素，可與體內(nèi)雌激素受體相結(jié)合，產(chǎn)生雌激素效應(yīng)[1-2]。高溫低濕環(huán)境下，霉變的玉米、高粱、小麥等谷類作物易產(chǎn)生ZEN，作為飼料原料的谷物被動物采食后，經(jīng)代謝可沉積于肉、蛋、奶等動物產(chǎn)品中，嚴(yán)重威脅動物體健康和食品安全。豬對玉米赤霉烯酮的雌激素效應(yīng)最為敏感，典型臨床癥狀為陰戶腫大、陰道和直腸脫垂以及乳腺增大，引起母豬的不孕、流產(chǎn)和假發(fā)情等繁殖障礙[3-5]。此外，ZEN還具有肝毒性、免疫毒性、細(xì)胞毒性和遺傳毒性，對腫瘤的發(fā)生也有一定影響[2，6]。

全世界范圍內(nèi)的谷物和飼料都受到霉菌毒素的威脅，嚴(yán)重威脅動物的生產(chǎn)性能和食品安全，每年給飼料工業(yè)和畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。中國作為一個農(nóng)業(yè)大國，尋求一種安全、有效的霉菌毒素脫毒方案尤為重要。霉菌毒素傳統(tǒng)的物理和化學(xué)脫毒方法，因其效果不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分損失大、改變飼料適口性等缺陷限制了在實(shí)際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用[8]。而微生物及生物酶降解，以其降解效率高、特異性強(qiáng)、對飼料和環(huán)境無污染等優(yōu)勢，受到研究者們的廣泛關(guān)注[9-10]。本課題組分離得到1株具有ZEN降解活性的細(xì)菌，其發(fā)酵液對ZEN降解率達(dá)到83.04%，經(jīng)16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），根據(jù)其功能特性將該菌命名為霉立解01G菌。由于枯草芽孢桿菌的商品制劑是經(jīng)國際公認(rèn)可直接飼喂動物的安全級(GRAS)微生物制品，應(yīng)用于開發(fā)動物飼料酶制劑的前景廣闊。本試驗(yàn)對篩選得到的霉立解01G菌進(jìn)行降解活性組分確定及組分性質(zhì)研究，同時將霉立解01G菌進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵、干燥，生產(chǎn)ZEN生物酶降解劑——霉立解，將其添加到ZEN自然霉變的青年母豬日糧中，觀察豬的外陰變化情況，以及霉立解01G菌對豬ZEN中毒癥狀的緩解作用，為實(shí)際生產(chǎn)中霉立解01G菌的應(yīng)用及ZEN污染飼料的控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

菌株篩選：從動物食糜、霉變糧食和土壤等樣品中分離得到的細(xì)菌，及實(shí)驗(yàn)室保藏的其他益生菌株。

霉立解01G菌：本課題組在雞腸道食糜中分離得到，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其發(fā)酵液對ZEN的降解率可達(dá)到83.04%。該株菌已經(jīng)保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.4297。同時，該株菌已被申請國家發(fā)明專利并獲授權(quán)(專利號：ZL 201010620651.2)。

1.2 ZEN污染飼料原料來源

ZEN污染日糧：在各地飼料原料供給廠采集霉變玉米樣本，選取一種僅被ZEN污染的樣本，替代正常日糧中的玉米。霉變玉米中ZEN檢測含量為486 μg/kg，黃曲霉毒素、嘔吐毒素、赭曲霉毒素均為未檢出。

1.3 霉立解的生產(chǎn)

由霉立解01G菌進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵、干燥生產(chǎn)得到，活菌數(shù)為 1×109CFU/g（由河南億萬中元生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。

1.4 主要試劑及儀器

ZEN標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；LB液體培養(yǎng)基（1 000 ml）：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g，pH值7.0～7.2（固體培養(yǎng)基添加16 g瓊脂）。

高效液相色譜儀(HPLC，島津LC-20AT)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、冷凍離心機(jī)、細(xì)胞破碎儀等。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計與試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)分為3個處理，試驗(yàn)設(shè)計見表1，對照組青年母豬飼喂正常玉米型日糧，試驗(yàn)組Ⅰ青年母豬飼喂霉變玉米型日糧（ZEN含量為238 μg/kg），試驗(yàn)組Ⅱ青年母豬飼喂霉變玉米型日糧（ZEN含量為240 μg/kg）+霉立解（2 kg/t）。全部日糧于試驗(yàn)正式開始前1周一次性配制，在試驗(yàn)前取樣，分析日糧中的養(yǎng)分含量及毒素水平。試驗(yàn)日糧為玉米-雜粕型基礎(chǔ)日糧，其營養(yǎng)水平參照NRC（1998）推薦標(biāo)準(zhǔn)配制，基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.6 試驗(yàn)動物與管理

選擇18頭平均體重為(36.64±1.52)kg的健康杜×長×大三元雜交青年母豬，隨機(jī)分到3個處理組，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，各處理間初始體重差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)開始前全豬舍清掃并消毒，試驗(yàn)期間每天清糞后消毒，單籠飼養(yǎng)，豬只自由采食和飲水。試驗(yàn)期為24 d，試驗(yàn)在河南億萬中元生物技術(shù)有限公司豬場進(jìn)行。

1.7 試驗(yàn)方法

1.7.1 ZEN降解菌的篩選及降解活性測定

降解ZEN的益生菌篩選，按照Gao等[11]的方法，每個樣品取1 g分別接種到10 ml LB培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h后，80℃水浴加熱15 min，將加熱后的發(fā)酵液在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)24 h。然后將不同形態(tài)的菌落接種到50 ml LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。取發(fā)酵液900 μl加入100 μl（5 mg/kg）ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，在37℃黑暗的培養(yǎng)箱中反應(yīng)72 h。以等量的LB培養(yǎng)基加ZEN為對照組，用高效液相色譜（HPLC）的方法對ZEN的降解率進(jìn)行測定。

1.7.2 霉立解01G菌降解ZEN活性組分的確定

將霉立解01G菌接種到50 ml/250 ml裝液量的LB培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，得到霉立解01G發(fā)酵液。取5 ml發(fā)酵液，4℃離心20 min(8 000 r/min)，分離上清液與菌體，上清液于4℃?zhèn)溆?；離心后的菌體用蒸餾水洗滌，再離心，取菌體加入5 ml蒸餾水制得菌懸液，備用；以同樣的方法再制備一份菌體，對菌體使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，然后溶于5 ml蒸餾水制成胞內(nèi)液備用。

1.7.3 霉立解01G菌發(fā)酵液活性組分性質(zhì)的研究

對霉立解01G菌發(fā)酵上清液分別進(jìn)行熱處理（100℃加熱10 min）和蛋白酶K處理（0.01 g/ml蛋白酶K與發(fā)酵上清液反應(yīng)2 h）。按上述方法進(jìn)行降解反應(yīng)試驗(yàn)，研究降解活性物質(zhì)的性質(zhì)。

1.7.4 日糧養(yǎng)分和毒素水平檢測

日糧中常規(guī)養(yǎng)分含量的測定按照張麗英(2003)的方法進(jìn)行。

參照GB/T 23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》的ZEN測定方法，并根據(jù)試驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整。利用免疫親和柱凈化，提取日糧中ZEN、黃曲霉毒素、嘔吐毒素和赭曲霉毒素，最后利用HPLC法對其含量定量分析。其中對ZEN、黃曲霉毒素、嘔吐毒素和赭曲霉毒素的最低檢測限為 1 μg/kg、0.1 μg/kg、0.1 mg/kg 和1 μg/kg。

1.7.5 陰戶測量與計算

試驗(yàn)開始后每天觀察并記錄豬只陰戶腫脹情況，用游標(biāo)卡尺測量陰戶長（a）、寬（b），并計算陰戶表面積(S)。計算公式S=（π×a×b）/4，比較各組豬只的陰戶增大及恢復(fù)效果。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用SAS 8.1軟件的一般線性模型（General linear model，GLM）程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為顯著水平，方差分析顯著者則進(jìn)行Duncan's法多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果分析

2.1 篩選到的降解ZEN的菌

本試驗(yàn)從動物食糜、霉變糧食和土壤等樣品中分離得到的細(xì)菌及實(shí)驗(yàn)室保藏的益生菌株中，篩選得到一株能夠降解ZEN的細(xì)菌，其發(fā)酵液對ZEN降解率達(dá)到83.04%。經(jīng)過16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌，并命名為霉立解01G菌。

2.2 霉立解01G菌降解ZEN活性組分的確定（見圖1）

圖1 霉立解01G菌不同組分對ZEN的降解率

由圖1可知，霉立解01G菌發(fā)酵液和上清液降解活性顯著高于菌懸液和胞內(nèi)液，其降解率分別達(dá)到83.04%和75.60%，而菌懸液和胞內(nèi)液的降解率僅為15.06%和26.11%。因此，初步認(rèn)為霉立解01G菌降解ZEN的活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵后的上清液中，是一種胞外分泌物質(zhì)。

2.3 霉立解01G菌發(fā)酵液活性組分性質(zhì)的研究（見圖2）

圖2 霉立解01G菌上清液經(jīng)熱處理和蛋白酶K處理后對ZEN的降解率

圖2結(jié)果顯示，霉立解01G菌發(fā)酵后的上清液經(jīng)熱處理和蛋白酶K處理后其對ZEN的降解率顯著降低，發(fā)酵后的上清液經(jīng)熱處理后對ZEN的降解率降低至23.06%，經(jīng)蛋白酶K處理后降低至18.24%。因此，可初步判斷霉立解01G菌對ZEN的降解活性物質(zhì)是一種細(xì)胞所產(chǎn)胞外酶。

2.4 霉立解01G菌對飼喂ZEN污染日糧青年母豬陰戶面積的影響（見表3、表4）

由表3可知，試驗(yàn)0～3 d各組間青年母豬陰戶面積均無顯著差異(P＞0.05)，未出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象。試驗(yàn)3～10 d，試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅱ豬陰戶面積大小水平相同，均高于對照組，并且出現(xiàn)紅腫癥狀。試驗(yàn)10～17 d，試驗(yàn)組Ⅱ的陰戶面積逐漸恢復(fù)至對照組水平，紅腫癥狀逐漸消失，而試驗(yàn)組Ⅰ陰戶面積仍然大于對照組且紅腫現(xiàn)象未消失。試驗(yàn)17～24 d，試驗(yàn)組Ⅰ陰戶面積均高于對照組和試驗(yàn)組Ⅱ，且紅腫現(xiàn)象未消失，而試驗(yàn)組Ⅱ與對照組水平相同。

表3 霉立解對飼喂ZEN污染日糧青年母豬陰戶面積的影響(mm2)

表4 霉立解對飼喂ZEN污染日糧青年母豬不同時期外陰面積的增加量變化(mm2)

由表4可知，在0～10 d試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅱ豬陰戶面積的增加量明顯大于對照組；而試驗(yàn)第10～17 d試驗(yàn)組Ⅱ增加量為負(fù)值且與對照組和試驗(yàn)組Ⅰ相比差異顯著，說明試驗(yàn)組Ⅱ由于霉立解01G菌的作用使外陰腫大現(xiàn)象顯著地改善。從試驗(yàn)0～24 d外陰的總增加量變化可以看出試驗(yàn)組Ⅰ有高于對照組的趨勢，而試驗(yàn)組Ⅱ增加量低于試驗(yàn)組Ⅰ。

3 討論

ZEN作為一種雌激素類真菌毒素，其作用效應(yīng)集中表現(xiàn)在對外周生殖器官的影響，可引起豬的雌激素過多癥，典型的臨床癥狀為陰戶濕腫、陰道和直腸脫垂以及乳腺增大，引起母豬的不孕、流產(chǎn)和假發(fā)情等繁殖障礙[12-13]。Teixeira等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.75 mg/kg ZEN飼喂(8.55±0.60)kg雌性仔豬，7 d時即出現(xiàn)陰戶紅腫，至試驗(yàn)第21 d，其陰戶面積、生殖道增重顯著高于對照組豬，而其子宮內(nèi)膜腺體和子宮黏膜上皮細(xì)胞高度均顯著高于未添加毒素組[12]。Andretta等報道，在日糧中添加2 mg/kg ZEN飼喂斷奶雌性仔豬，可顯著增加生殖道長度和重量，并且其陰戶體積約為對照組的8.2倍，結(jié)果表明，ZEN及其代謝產(chǎn)物會產(chǎn)生類雌激素效應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加 1.1、2.0、3.2 mg/kg ZEN，斷奶母豬陰戶出現(xiàn)紅腫，且ZEN濃度越高，陰戶面積越大，面積增加越快，其長寬高和面積水平均顯著高于對照組[14]。

眾所周知，枯草芽孢桿菌是一類好氧生長、可形成芽孢的革蘭氏陽性菌，對人畜無毒無害、不污染環(huán)境，而且還具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，能分泌多種抗菌物質(zhì)和酶，是國際公認(rèn)的可在飼料中直接使用的微生物菌株。霉立解01G菌是本課題組從雞腸道食糜中篩選得到的枯草芽孢桿菌，進(jìn)一步的試驗(yàn)證明，該菌株對ZEN的降解活性組分主要存在于發(fā)酵上清液中，菌懸液和胞內(nèi)液活性較低。同時，在上清液經(jīng)加熱和蛋白酶K處理后，其ZEN降解活性顯著地降低，初步認(rèn)為霉立解01G菌對ZEN降解活性物質(zhì)是一種細(xì)胞產(chǎn)生的胞外酶。

本試驗(yàn)除研究了霉立解01G菌在體外對ZEN的降解作用之外，同時研究了低濃度ZEN污染的自然霉變?nèi)占Z對青年母豬的外陰大小影響及霉立解在ZEN污染日糧中的應(yīng)用效果。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)第10 d時，能觀察到試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅱ由于ZEN的作用，豬外陰出現(xiàn)明顯紅腫現(xiàn)象；在試驗(yàn)17 d時，由于霉立解01G菌的作用，試驗(yàn)組Ⅱ豬外陰紅腫癥狀有減輕的趨勢；在試驗(yàn)24 d時，試驗(yàn)組Ⅱ與對照組外陰大小水平基本相同，而試驗(yàn)組Ⅰ外陰仍有紅腫癥狀且明顯大于試驗(yàn)組Ⅱ與對照組，說明日糧ZEN含量在240 μg/kg時，就可使青年母豬出現(xiàn)不同程度的ZEN中毒現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為外陰紅腫；而在其日糧中添加霉立解01G菌可在一定程度上緩解或者減輕這種癥狀；且該菌發(fā)揮作用效果需要至少1周的時間，主要原因是，菌在動物消化道定植需要一定的適應(yīng)時間，當(dāng)菌適應(yīng)動物腸道環(huán)境后就可大量生長繁殖、分泌活性物質(zhì)，發(fā)揮其作用效果。因此，霉立解01G菌在實(shí)際生產(chǎn)中具有良好的開發(fā)前景和應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

課題組篩選得到的枯草芽孢桿菌(霉立解01G菌)對ZEN具有較高的降解活性；體外降解試驗(yàn)初步證明，降解活性物質(zhì)是該菌分泌的一種胞外酶。同時，動物試驗(yàn)證明，日糧中含有240 μg/kg的ZEN可導(dǎo)致青年母豬陰戶腫脹，在ZEN霉變?nèi)占Z中添加霉立解01G菌可以顯著緩解這種中毒癥狀。