賈寶輝，韓飚，陳軍喜，劉艷，高新愿

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南昌 330003)

細(xì)菌等病原體侵入機(jī)體后，通過某些特定的途徑觸發(fā)全身性炎性反應(yīng)。感染性休克或敗血癥本質(zhì)上就是一種失控的自我破壞性的全身性炎性反應(yīng)過程。敗血癥是感染引起的全身性炎性反應(yīng)，而感染性休克則是敗血癥的某個嚴(yán)重形式或嚴(yán)重階段[1]。高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)廣泛參與炎癥反應(yīng)環(huán)節(jié)，具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)內(nèi)皮功能、抗血栓形成等作用。體外實驗證實HDL能減少脂多糖 (LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，HDL對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥動物模型有保護(hù)作用，其機(jī)理與中和LPS有關(guān)[2]。敗血癥／感染性休克的主要病理生理基礎(chǔ)在于全身性炎性反應(yīng)綜合征。HDL對敗血癥／感染性休克的作用如何，目前尚不清楚。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法復(fù)制敗血癥小鼠模型，觀察HDL對小鼠總體生存率、重要臟器組織病理學(xué)變化及血漿促炎性細(xì)胞因子水平的影響，探討HDL對敗血癥的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康昆明小鼠，雌性，體重20-25g(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。60只小鼠隨機(jī)分為對照組(假手術(shù)組)、CLP組和HDL組共3組，每組20只，用于觀察生存率和記錄平均生存時間。另取36只小鼠隨機(jī)分為對照組、CLP組和HDL組，每組12只，用于觀察12h肝、肺組織病理學(xué)變化和測定2h血漿腫瘤壞死因子水平。模型制備成功后立即尾靜脈注射HDL，以后每間隔8h追加注入，直至模型制備成功后48h。

1.2 小鼠敗血癥模型制備 參考文獻(xiàn)[3]方法建立敗血癥／感染性休克小鼠模型。動物術(shù)前禁食12h,腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的水合氯醛350 mg/kg麻醉。于左下腹作長約1-1.5 cm切口，游離腸系膜和盲腸，4號絲線在距盲腸盲端2/3長度處環(huán)行結(jié)扎,12號針在距盲端1cm處貫通穿刺，擠出糞便少許，將腸系膜和盲腸回納入腹腔。逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后立即皮下注射生理鹽水3ml/100g，以補(bǔ)充術(shù)中液體丟失;同時每只小鼠肌注青霉素2×104U以預(yù)防切口感染。術(shù)后小鼠自由進(jìn)食飲水。對照組僅做開腹、盲腸游離及關(guān)腹術(shù)，其余同CLP組。

1.3 一般狀況和生存率 觀察動物有無萎靡、寒顫、豎毛、腹瀉、膿性尿及眼角分泌物增加，及其呼吸，大小便，飲食和活動情況。共計觀察7d結(jié)束。記錄3組動物48h內(nèi)總體生存率和平均生存時間。

1.4 病理學(xué)檢查 CLP后20h取肝、肺、腸組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片,HE染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。另取適量肝、肺組織4℃下以2.5%戊二醛溶液固定24h，再以1%鋨酸固定1.5h，脫水包埋制備透射電鏡切片，在H-600型透射電鏡(Hitachi公司,日本)下觀察組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5 血漿促炎性細(xì)胞因子濃度測定 分別于模型制備成功后2h處死動物取血，離心后獲取血漿。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿腫瘤壞死因子-α(tmor necrosis factor-alpha，TNF-α)的濃度。 試劑盒購自武漢博士德生物公司。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。使用CurveExpert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出待測樣品濃度值，以pg/ml表示。每個待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均作雙復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用生存分析法(survival analysis)進(jìn)行組間比較，并繪制各組生存率曲線。多組間比較采用單因素方差分析，多組的兩兩間比較采用SNK檢驗。P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及大體觀 與對照組相比，CLP小鼠麻醉蘇醒延遲，活動減少，嗜睡，精神萎靡，食欲減退，體重減輕，腹瀉、膿尿、眼角分泌物增多。瀕死前部分出現(xiàn)皮下出血、鼻腔內(nèi)血性分泌物滲出、寒顫、呼吸窘迫，四肢肌張力增高甚或頸項強(qiáng)直。解剖可見CLP小鼠腹腔混濁膿性滲出液較多，伴惡臭；盲腸腫脹、壞疽和粘連；空腸腸管脹氣；肺臟體積增大,色暗紅,表面可見出血斑點(diǎn)。肝臟和其余臟器肉眼觀察未見明顯異常改變。HDL組小鼠一般狀況及大體形態(tài)學(xué)改變均較CLP組明顯減輕。

2.2 總體生存率和平均生存時間 術(shù)后24、36、48h總體生存率分別為：對照組100%、100%、100%;CLP組 40.0%、25.0%、20.0%;HDL組 80.0%、63.3%、56.7%。動物平均生存時間為：對照組7d，CLP組18h，HDL組6d。與CLP組相比，HDL組生存率明顯提高(P<0.01)。

2.3 病理學(xué)變化 肝組織 光鏡下可見CLP組肝細(xì)胞腫脹、空泡樣脂肪變性，點(diǎn)狀或小片狀壞死。肝臟門管區(qū)局灶性膿腫，肝血竇擴(kuò)張，中性粒細(xì)胞浸潤于血管壁。HDL組肝細(xì)胞濁腫，輕度脂肪變性，未見明顯壞死灶。肝血竇中中性粒細(xì)胞浸潤較輕，電鏡下對照組肝細(xì)胞核膜清晰，線粒體、溶酶體結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布于核周，糖原豐富。CLP組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多脂肪滴，溶酶體增多，線粒體水腫，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，肝細(xì)胞內(nèi)大量異染色質(zhì)邊集凝聚成塊，核固縮。HDL組細(xì)胞核中僅有少量異染色質(zhì)，線粒體輕度水腫，脂肪滴可見，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。

肺組織光鏡下CLP組肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管充血,中性粒細(xì)胞浸潤，微血栓形成。肺間質(zhì)水腫，肺泡隔疏松增寬,炎性細(xì)胞浸潤明顯。HDL組小血管及毛細(xì)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤較輕，肺間質(zhì)輕度水腫，肺泡隔增寬不明顯。電鏡下CLP組肺泡毛細(xì)血管腔內(nèi)可見中性粒細(xì)胞集聚，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，線粒體腫脹空泡化，輕度板層小體排空。與CLP組相比，HDL組變化不明顯。

2.4 血漿TNF-α濃度的變化 與CLP組 (213.40±20.17)比較，術(shù)后 4hHDL組 TNF-α 濃度(185.07±8.28)明顯降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的組成成分，是引起敗血癥/感染性休克的重要致病因子之一。內(nèi)毒素與存在于單核/巨噬細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體相互作用后，通過一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等促炎性細(xì)胞因子在體內(nèi)大量表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生全身性過度炎性反應(yīng)，這是敗血癥/感染性休克的主要病理生理機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，鼠遭受CLP術(shù)后，血漿中TNFα顯著升高，與肝組織炎癥病理改變明顯相關(guān)。而應(yīng)用HDL后，血漿中TNFα含量顯著降低，肝組織炎性病理改變明顯減輕，表明HDL可減輕全身性炎性反應(yīng)，并具有保護(hù)肝功能的作用。其機(jī)制可能是抑制機(jī)體釋放TNFα，從而拮抗肝臟組織乃至全身性的炎性反應(yīng)。

TNF是炎癥反應(yīng)早期階段的介質(zhì)，是外源物質(zhì)入侵引起的炎癥反應(yīng)中的基本表現(xiàn)。TNF可激活其他細(xì)胞釋放細(xì)胞因子如白介素 1(IL-1)、高遷移率物質(zhì)B1(HMGB1)和炎癥介質(zhì)如類花生酸、一氧化氮、活性氧族,這些物質(zhì)能引起進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)和組織損傷。TNF可擴(kuò)大并延長炎癥反應(yīng),降低TNF活性可限制炎癥反應(yīng)。

高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)廣泛參與炎癥反應(yīng)環(huán)節(jié)，具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)內(nèi)皮功能、抗血栓形成等作用。HDL的蛋白成分復(fù)雜，功能與其脂質(zhì)、載脂蛋白、酶以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)量與質(zhì)量有關(guān)。HDL載脂蛋白部分主要是載脂蛋白AI及載脂蛋白A II(apoA I，apoA II)。體外實驗證實HDL能減少脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，HDL對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥動物模型有保護(hù)作用，其機(jī)理與中和LPS有關(guān)[4,5]。臨床研究亦證實低HDL水平的重癥患者預(yù)后差[6]。HDL對炎癥細(xì)胞及炎癥過程的作用廣泛。HDL抑制NF-κB合成、抑制黏附分子1、IL-1、E選擇素等表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的黏附。已知NF-κB的激活以及其它炎癥因子如IL-1、IL-6都能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等TNF-α產(chǎn)生增加。

本研究證實高密度脂蛋白抗炎作用的受體機(jī)制和受體后作用靶點(diǎn)，為感染性休克肺損傷的治療開辟了新的研究方向，并為開發(fā)高密度脂蛋白新的治療用途提供理論幫助。

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