周玨宇，石 嶸，鄭文嶺，馬文麗

(南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州510515)

細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk)的異常表達、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)的缺失、以及檢測點的異常等都將使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致癌變。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來揭示出的一類長度約為21～25個核苷酸的非編碼小分子RNA(non-coding small RNA)，它們通過與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達或抑制靶蛋白的翻譯。大量證據(jù)表明，miRNAs可通過調(diào)控其靶基因參與的信號通路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的功能［1－2］。而某些miRNAs與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，它們可以通過靶向 E2F、Cdks、cyclins、CKI等促進或阻滯細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，進而調(diào)控細(xì)胞周期，并且這種由miRNAs介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控方式與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3－5］。因此，闡明 miRNAs在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所扮演的功能角色，尤其是其在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制是一個值得深入研究的方向［6］。

1 細(xì)胞周期與腫瘤

細(xì)胞周期是一個由多種蛋白因子協(xié)同參與的復(fù)雜而精細(xì)的過程，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)組成了最基本的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，負(fù)責(zé)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變和檢測點的完成。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的分子主要包括cyclins、Cdks、CKI，以及抑癌基因編碼蛋白P53和pRb等。其中，cyclin和Cdk在細(xì)胞周期調(diào)控中起核心作用，cyclin是其對應(yīng)的cyclin-Cdk復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基，其時相性表達是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵。這些蛋白在細(xì)胞周期運行過程中又依次受到諸多蛋白質(zhì)(如 P53、P21、P16、CDC25 等)的調(diào)控。而 cyclin-Cdk復(fù)合物的下游底物又包括pRb和E2F等。此外，細(xì)胞內(nèi)還存在著其他一些調(diào)控點(如限制點或檢測點)來確保細(xì)胞周期的正常運行。

細(xì)胞周期紊亂是腫瘤最主要的發(fā)生機制，在細(xì)胞周期的整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，各類分子的異常都有可能引起腫瘤。為了闡明腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的具體機制，科學(xué)家們從不同的角度對細(xì)胞周期與癌基因、抑癌基因、生長因子以及細(xì)胞增殖分化的關(guān)系進行研究，以尋找控制細(xì)胞周期的神奇“開關(guān)”，并從中篩選得到了一些具有細(xì)胞周期依賴性的重要基因［7－9］。上述研究不僅有助于發(fā)現(xiàn)更多參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的靶標(biāo)分子，從細(xì)胞周期調(diào)控水平上闡明腫瘤的發(fā)病機制，而且為腫瘤的臨床診斷和治療提供了重要的線索和依據(jù)。

2 miRNAs與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和大量miRNA的發(fā)現(xiàn)，這類小RNA在生物體內(nèi)的重要意義才被科學(xué)界廣為接受，并成為近10年來的研究熱點。據(jù)預(yù)測，人體內(nèi)大約有1 000多種miRNA分子，占人類基因總數(shù)的1%左右。但它們不是由基因直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，而是由RNA聚合酶Ⅱ首先從其編碼基因轉(zhuǎn)錄出較長的初級轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)，然后在核內(nèi)由RNaseⅢ家族的Drosha和DGCR8形成的蛋白復(fù)合體剪切成長度約為70 nt、帶發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)［10］，并由 Exportin-5/Ran-GTP 轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)［11］，最后在胞質(zhì)內(nèi)由RNaseⅢ家族的另一成員Dicer剪切加工成長度約為22個堿基的成熟miRNA［12］，進 一步 形 成 RNA 誘 導(dǎo) 沉 默 復(fù) 合 物(RNA-induced silencing complex，RISC)，結(jié)合到靶基因mRNA的3'UTR，從而調(diào)控靶基因的表達。

miRNA作為生物體內(nèi)一類重要的基因表達調(diào)控分子，每個miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個靶基因，而不同的miRNA分子也可以協(xié)同調(diào)控同一mRNA分子。miRNA與其靶標(biāo)分子共同組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制細(xì)胞內(nèi)多種重要的生命活動［13］。這類小分子RNA被譽為是“生物學(xué)中的暗物質(zhì)，存在于我們周圍卻幾乎逃脫了所有的視線”，它們的發(fā)現(xiàn)是對中心法則中RNA次要的中介角色的重要補充，必將促使生物學(xué)家重新思考細(xì)胞遺傳調(diào)控及其發(fā)育等方面的問題。盡管對miRNA的研究還處于起步階段，但是據(jù)推測miRNAs在真核生物體內(nèi)對基因表達的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要，它們可能代表了一種新的層次上的基因表達調(diào)控方式。正因為在生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、以及腫瘤等疾病發(fā)生中的重要作用，miRNAs領(lǐng)域的研究備受關(guān)注。

“癌microRNAs”(Oncomirs)這一嶄新概念的提出開辟了將miRNAs應(yīng)用于腫瘤學(xué)相關(guān)研究的新篇章［14］。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用［1，15］。而某些具有抑癌基因或癌基因功能的miRNAs分子可以通過直接靶向 E2F、Cdks、cyclins、CKI等促進或阻滯細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，進而調(diào)控經(jīng)典的細(xì)胞周期信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，通常具有癌基因功能的 miRNAs 分 子 (如 miR-106-25［16］、miR-27a［17］、miR-221/222［18－19］、miR-17-92［20－21］等)在細(xì)胞內(nèi)表達升高可能通過促進G1/S期的轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞周期進程;而具有抑癌基因功能的miRNAs分子(如let-7 family［22］、miR-15/16［23－24］、miR-34 family［25－26］、miR-124/137［27－28］、miR-107［29］、miR-19a［30］等)在細(xì)胞內(nèi)的過表達，則可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，延緩細(xì)胞周期進程。此外，某些miRNAs還能與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子(如c-Myc、E2F、P53等)協(xié)同發(fā)揮作用，增強轉(zhuǎn)錄因子作用的同時又能抑制促增殖的細(xì)胞周期蛋白的過度表達［6］。這些研究充分提示，miRNAs亦是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分之一。因此，深入探討那些受到miRNAs調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)信號通路，不僅詮釋了一個新的研究領(lǐng)域，而且有助于加深我們對經(jīng)典的細(xì)胞周期調(diào)控機制的認(rèn)識和理解，同時也將為揭示miRNA的異常表達與腫瘤細(xì)胞周期紊亂的關(guān)系提供嶄新的思路。

3 miRNA的研究策略

相對于數(shù)量龐大的miRNA來說，已知功能的miRNA還相對較少。隨著研究方法不斷發(fā)展和某些高通量的新技術(shù)的應(yīng)用，為探索miRNA世界的奧秘提供更多的選擇和幫助。

3.1 miRNA的鑒定

目前主要采用生物信息學(xué)方法和直接克隆的方法。miRNA克隆所依賴的結(jié)構(gòu)特征是其特異的5'端磷酸基團與3'末端羥基基團，以T4 RNA連接酶在分子末端加上連接子，再利用RT-PCR方法擴增獲得目的片段，克隆到合適的載體中，測序驗證。所得到的小分子RNA需要生物信息學(xué)方法與分子生物學(xué)方法確認(rèn)，進而注冊到miRNA數(shù)據(jù)庫［31］。

3.2 miRNA表達水平的檢測

目前研究miRNA表達的方法主要包括Northern blotting、實時定量PCR、RNA酶保護分析(ribonuclease protection assay，RPA)、磁珠流式檢測(bead-based flow cytometric assay)、原位雜交(in situ hybridistation)、高通量的 miRNA表達譜芯片(miRNA microarray)、miRNA深度測序(miRNA deep sequencing)等。

Northern雜交:類似于經(jīng)典的mRNA檢測方法，但是過程相對煩瑣，且耗時費力，對RNase污染非常敏感，且在檢測低豐度miRNA時欠靈敏。經(jīng)典的Northern雜交技術(shù)仍不可替代，特別是在驗證芯片結(jié)果及降低其假陽性方面起著至關(guān)重要的作用。

熒光定量PCR:可用于miRNA表達水平的定量檢測，且具有特異性高、靈敏度好、重復(fù)性好、快速簡單等優(yōu)點，主要方法有莖環(huán)法［32］和加尾法［33］等。與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏地檢測出低豐度表達的靶分子，并適于高通量篩選。此法既可檢測小RNA前體，又可檢測成熟小RNA的表達。

RNA酶保護分析:是一種基于液相雜交的新方法，具有簡單、快速、靈敏度高的特點，是Northern雜交的100倍。但由于價格昂貴，目前尚難于廣泛應(yīng)用。

磁珠流式檢測:其原理是將結(jié)合探針的磁珠浸入到由兩種不同熒光染料組成的混合物中，RT-PCR法擴增miRNA，產(chǎn)物與磁珠上的探針雜交，經(jīng)染色后用流式細(xì)胞儀對彩色磁珠計數(shù)，顏色代表特定的miRNA，信號強度則表示其豐度。此方法能更好地捕獲待測靶miRNA分子，最大程度地避免固態(tài)芯片中的交叉反應(yīng)，但需對磁珠進行預(yù)先編碼和雜交后解碼，且成本較高。

原位雜交:可直觀了解miRNA的時空表達模式，常用地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等方式。鎖核苷酸(locked nucleic acid，LNA)探針因其與靶分子結(jié)合后可以增加異源雙鏈分子的熱力學(xué)穩(wěn)定性，提高反應(yīng)特異性，被廣泛用于原位雜交。

miRNA表達譜芯片:芯片無疑是高通量檢測miRNA表達情況的最佳選擇，它以雜交為基礎(chǔ)，目前已被廣泛用于特異組織或細(xì)胞內(nèi)miRNA表達譜的研究。此法對miRNA表達分析是間接的，在研究過程中仍存在特異性和靈敏度不高等缺點，因此結(jié)果存在一定的假陽性，需要輔助其他更為準(zhǔn)確的表達研究方法加以驗證。

miRNA深度測序:熒光定量PCR和表達譜芯片局限于檢測已知 miRNA的表達，無法發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子。miRNA深度測序技術(shù)能夠直接對樣本中特定大小的miRNA分子進行高通量測序，可以在無需任何miRNA序列信息的前提下研究miRNA的表達譜，并發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 miRNA分子，為miRNA表達研究提供了更全面的方法，為進一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。

3.3 miRNA的功能研究

通?；蚬δ苎芯砍３２捎眠^表達或干涉(抑制、敲除)等方法，miRNA研究也不例外。前者通過提高該miRNA的表達水平，檢測過表達所引起的細(xì)胞表型變化，初步闡釋其可能的功能。體外合成雙鏈RNA分子進入細(xì)胞內(nèi)可以進一步被Dicer加工，得到成熟的miRNA，可用于瞬時作用的研究。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或動物實驗研究需構(gòu)建表達載體或選擇病毒載體，蛋白質(zhì)編碼的載體可用于miRNA細(xì)胞水平的表達研究，病毒載體則可以直接用于動物實驗，但是也有一定的局限性。需要注意的是，過表達研究中很難排除內(nèi)源性表達的影響，因此，要得到理想的結(jié)果往往還需要功能抑制(loss-of-function)或敲除該miRNA來進一步驗證。

基于miRNA自身的特點，可以在基因水平上抑制miRNA的表達，也可采用反義核酸分子抑制其表達。前者如條件性敲除miRNA的加工因子Dicer，可得到所有成熟miRNA的缺失體，但此方法無法獲知單個miRNA的功能。在Dicer缺失情況下，單獨過表達某種miRNA即可直接用于其功能研究。采用反義核酸分子，如2'-O甲基修飾物、LNA修飾物、miRNA拮抗劑antagomir等與靶miRNA互補結(jié)合，可達到抑制miRNA表達的目的。2'-O-甲基修飾物可用于miRNA的體外功能研究，但若進行體內(nèi)實驗則須采用antagomir。它具有劑量依賴性，并可達到miRNA長期抑制的效應(yīng)，而且不會影響同一基因簇內(nèi)其他miRNAs。

上述正反兩方面的研究相結(jié)合可很好地用于miRNA的功能研究。

3.4 miRNA 靶基因的鑒定

miRNA的功能研究很大程度上與其所調(diào)控的靶基因有關(guān)，鑒定miRNA的靶基因是該領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容，同時也是難點。目前，靶基因的確定主要是以軟件預(yù)測為主，根據(jù)miRNA與靶基因3'UTR結(jié)合的結(jié)構(gòu)、熱動力學(xué)等特點，借助生物信息學(xué)進行靶基因的預(yù)測。常見的靶標(biāo)基因預(yù)測軟件有TargetScan、PicTar、TargetScanS、miRanda、RNA22、RNA-hybrid、RNAFold、DIANA-MicroT 等［34］。

生物信息學(xué)方法預(yù)測的靶基因的數(shù)量往往要超過實際的數(shù)量，且存在假陽性，因此需要通過分子生物學(xué)實驗進一步驗證。通過過表達和抑制所要研究的miRNA，借助熒光報告基因系統(tǒng)，可用于鑒定受到該miRNA調(diào)節(jié)的基因以及該miRNA所影響和調(diào)控的生物學(xué)過程。導(dǎo)入化學(xué)合成的小分子miRNA mimics或拮抗劑antagomir，觀察靶mRNA及編碼蛋白表達以及細(xì)胞、動物水平的表型變化，進行信號通路研究，這是目前miRNA功能研究的常用方法。在確定了靶mRNA之后，找到位于3'UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點是研究者下一步關(guān)心的內(nèi)容。通過生物信息學(xué)分析獲得候選的miRNA結(jié)合區(qū)域，將野生型和結(jié)合位點突變的3'UTR序列克隆入熒光素酶報告載體，通過觀察miRNA對發(fā)光強度的影響對結(jié)合位點加以驗證。采用合適的報告基因系統(tǒng)驗證miRNA對其靶基因的調(diào)控作用，簡便易行，但仍存在一定局限性，即不能完全模擬細(xì)胞內(nèi)真實的調(diào)控環(huán)境。因此，當(dāng)探討特異miRNA在某一生理或病理過程中的功能，尋找其靶基因時，應(yīng)選擇合適的細(xì)胞模型或其他有效的實驗工具，以真實體現(xiàn)miRNA的調(diào)控作用，為其功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論與展望

隨著對非編碼RNA研究的不斷深入，它們在細(xì)胞周期信號通路中的生物學(xué)意義日益凸現(xiàn)。miRNA不僅可通過加快細(xì)胞周期進程發(fā)揮促增殖效應(yīng)，而且也能阻滯細(xì)胞周期產(chǎn)生抗增殖效應(yīng)。一些miRNAs可能同時具有這兩方面的效應(yīng)，如miR-17-92簇中的部分miRNAs;另一些miRNAs則受細(xì)胞周期特異性轉(zhuǎn)錄因子(如c-Myc或E2F等)的調(diào)控。可見，miRNAs在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中作用具有復(fù)雜多樣性。miRNAs的功能研究很大程度上與靶基因的確定有關(guān)，然而此領(lǐng)域的研究進展緩慢，很大程度上緣于目前尚無有效的大規(guī)模篩選并驗證靶基因的方法。高通量的蛋白組學(xué)技術(shù)可能有助于此問題的解決，從而加快靶基因驗證的步伐［35－36］。此外，同一種miRNA在不同的細(xì)胞內(nèi)可能發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)，其靶基因也不盡相同，使其功能在細(xì)胞間存在較大差異。研究表明，miR-29b僅在細(xì)胞周期M期表達，其他階段不表達或表達較低，而miR-29a的表達在細(xì)胞周期各個階段均持續(xù)恒定地表達［37］，提示miRNAs的調(diào)控可能具有細(xì)胞周期特異性，但尚需進一步探討?？紤]到miRNAs在細(xì)胞周期調(diào)控及腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要意義，上述問題的解決將有助于進一步完善細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示腫瘤的發(fā)病機制。

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