吳 瑕，朱述陽*，鄭玉龍，劉文靜，陳云峰，倪文靜，趙 玲

(1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇徐州221002;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬淮安第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇淮安223001)

氣道重塑是難治性哮喘的重要病理基礎(chǔ)之一，其中氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)過度增殖是氣道重塑的重要環(huán)節(jié)［1］。難治性哮喘患者多伴有肥胖及高水平的瘦素［2］。瘦素(leptin)是由脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)，與其受體(OB-R)在哮喘發(fā)病機(jī)制具有重要作用。本研究前期實驗表明，大鼠ASMCs表面有瘦素受體表達(dá)，瘦素能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠ASMCs增殖，提示瘦素及其受體參與了哮喘的氣道重塑進(jìn)程［3］。

噻托溴銨(tiotropium)是一種新型長效抗膽堿類藥物，其擴(kuò)張支氣管作用持久，對于重癥哮喘特別是難治性哮喘具有較好的臨床療效。近年研究發(fā)現(xiàn)，除了持久的支氣管擴(kuò)張作用以外，噻托溴銨還可以抑制氣道重塑，但具體機(jī)制尚不明確［4-5］。本研究用體外培養(yǎng)的大鼠ASMCs，觀察噻托溴銨對瘦素刺激后產(chǎn)生的促大鼠ASMCs增殖作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級6～7周齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量150～200 g［徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(蘇)2010-0003］;瘦素(Alexis公司);噻托溴銨(Boehringer Ingelheim公司);兔抗大鼠瘦素受體抗體(武漢博士德公司);CCK-8法檢測試劑盒(南京凱基公司);Trnzol總 RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒及real time-RT-PCR兩步法檢測試劑盒(北京天根公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ASMCs培養(yǎng)及鑒定:按文獻(xiàn) ［3］常規(guī)培養(yǎng)大鼠ASMCs。實驗選用第4～6代細(xì)胞。培養(yǎng)的ASMC經(jīng)形態(tài)學(xué)和α平滑肌肌動蛋白 (smooth muscle α-actin，SM-α-actin) 免疫組織化 學(xué) 方 法鑒定。

1.2.2 ASMCs增殖的 CCK-8測定:取第 5代ASMCs，隨機(jī)分為:對照組，每孔加DMEM;瘦素干預(yù)組，每孔加瘦素(100 μg/L)，再分別加入 15、30、60及120 μg/L的噻托溴銨。每組設(shè)置6個復(fù)孔。按文獻(xiàn)方法［3］培養(yǎng)細(xì)胞后，每孔加 CCK-8 10 μL培養(yǎng)2 h，在波長450 nm處測各孔的吸光度(A)值。

1.2.3 瘦素受體mRNA表達(dá)測定:熒光實時定量RT-PCR法:上述各組干預(yù)24 h后收集 ASMCs，Trnzol法提取總RNA，紫外分光光度法測 RNA濃度。擴(kuò)增瘦素受體基因引物序列:上游:5'-CAGATT CGATATGGCTTAAATGG-3'，下游:5'-GTTAAAATTC ACAAGGGAGGCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度474 bp。擴(kuò)增內(nèi)參照β-actin基因引物序列:上游:5'-CGTAAAG ACCTCTATGCCAA-3'，下游:5'-AGCCATGCCAAATG TGTCAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為473 bp。PCR擴(kuò)增條件為:94℃ 2 min，94℃ 45 s，72℃ 90 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。Ct值表示每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個模板Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。采用相對定量方式表示各組瘦素受體mRNA表達(dá)，以每個樣本目的基因Ct平均值減去內(nèi)參Ct平均值，對應(yīng)為每個樣本的Ct值(△Ct)。

1.2.4 瘦素受體蛋白表達(dá)的測定:Western blot檢測，上述各組干預(yù)24 h后提取細(xì)胞蛋白。依次經(jīng)配膠、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)及封閉后，加入兔抗大鼠瘦素抗體過夜，洗膜后，加入二抗 (小鼠抗兔IgG)孵育2 h，以NBT/BCIP顯色后用image J軟件分析條帶吸光度值，以目的蛋白/內(nèi)參照吸光度比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)來表示各組蛋白表達(dá)，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ASMC鑒定結(jié)果

倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的ASMCs呈梭形，平行生長，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯呈峰谷狀。免疫熒光染色法表明，抗平滑肌α-actin抗體呈陽性染色者，胞質(zhì)內(nèi)可見大量的綠色熒光，證實所培養(yǎng)細(xì)胞為 ASMCs(圖1)。

圖1 ASMCs的鑒定Fig 1 Identification of airway smooth muscle cells

2.2 噻托溴銨對瘦素促ASMCs增殖的影響

各組干預(yù)24 h后測ASMCs增殖，瘦素組較對照組A值明顯升高(P＜0.05)。隨著噻托溴銨濃度增高，其各濃度組A值漸下降，與其濃度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)(表1)。

表1 ASMCs的增殖Table 1 ASMCs proliferation of different group± s，n=6)

表1 ASMCs的增殖Table 1 ASMCs proliferation of different group± s，n=6)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with leptin group.

group avalue control 0.967±0.005 leptin(100 μg/L) 1.065 ±0.003*tiotropium(15 μg/L) 1.061 ±0.002*30 1.053±0.003*60 1.034±0.004*#120 1.030±0.002*#

2.3 ASMCs中瘦素受體蛋白表達(dá)

與對照組相比，瘦素組瘦素受體蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。隨著噻托溴銨濃度增高，瘦素受體蛋白表達(dá)呈濃度依賴性逐漸下降(P＜0.01)(圖2，表2)。

2.4 ASMCs中瘦素受體mRNA表達(dá)

與對照組相比，瘦素組△Ct值最低，瘦素受體mRNA表達(dá)明顯增強 (P＜0.05);加入噻托溴銨后瘦素受體mRNA表達(dá)呈濃度依賴性下降(P＜0.05)(圖3，表2)。

3 討論

圖2 Western blot檢測瘦素受體蛋白表達(dá)Fig 2 The expression of leptin receptor protein

表2 瘦素受體相對表達(dá)Table 2 Relative expression of leptin receptor± s，n=6)

表2 瘦素受體相對表達(dá)Table 2 Relative expression of leptin receptor± s，n=6)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with leptin group.

group mRNA(△Ct)protein#control 14.03±1.84 0.327±0.011 leptin(100 μg/L) 3.62 ±1.22* 0.541 ±0.016*tiotropium(15 μg/L) 4.95 ±0.93* 0.514 ±0.017*30 8.28±1.67*# 0.468±0.025*#60 12.87±1.77# 0.331±0.023#120 12.71±1.40# 0.313±0.017

圖3 瘦素受體mRNA熒光實時定量PCR擴(kuò)增曲線Fig 3 Real-time PCR amplification curve of leptin receptor mRNA

肥胖是哮喘的危險因素之一，且使哮喘更易發(fā)生難以控制的類型。重癥哮喘或難治性哮喘患者多有血清瘦素水平的升高［2］。瘦素是脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)，其受體(OB-R)在小鼠和人的肺泡、支氣管上皮細(xì)胞及ASMCs上均有表達(dá)，研究表明瘦素與其受體在哮喘發(fā)病機(jī)制中具有促炎性反應(yīng)及免疫調(diào)控等作用［6］，但有關(guān)瘦素對 ASMCs的作用研究甚少。本研究證實瘦素干預(yù)后大鼠ASMCs增殖活性顯著增加，與本研究前期實驗［3］結(jié)果一致，提示瘦素可通過此途徑參與氣道重塑。研究也發(fā)現(xiàn)瘦素可于體外上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞瘦素受體的表達(dá)［7］，但在ASMCs中研究甚少，本研究發(fā)現(xiàn)，瘦素干預(yù)后可于體外上調(diào)ASMCs瘦素受體表達(dá)。

噻托溴銨是一種新型選擇性M3膽堿能受體拮抗劑，它不僅可以舒張氣道平滑肌，而且具有抗炎性反應(yīng)、抑制氣道重塑等作用。有不少報道其在哮喘特別是在難治性哮喘治療中具有作用［4］。目前許多研究發(fā)現(xiàn)噻托溴銨對氣道重塑有保護(hù)作用，可能的機(jī)制包括:抑制ASMCs絲裂反應(yīng)［8］、使肺泡巨噬細(xì)胞合成轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)陽性表達(dá)率顯著下降［9］(TGF-1是氣道重塑主要調(diào)控因子，直接影響氣道壁膠原沉積，促進(jìn)纖維化形成［10］)、抑制ASMCs體積增大增厚及收縮蛋白質(zhì)的表達(dá)［11］、抑制ASMCs增殖［12］等，提示噻托溴銨可通過多種途徑抑制哮喘病理生理過程中氣道重塑的發(fā)生，有關(guān)噻托溴銨與瘦素之間的研究甚少。本實驗發(fā)現(xiàn)，噻托溴銨于體外可抑制瘦素促大鼠ASMCs的增殖;噻托溴銨可呈濃度依賴性下調(diào)瘦素受體mRNA及蛋白表達(dá)水平，提示噻托溴銨可能通過下調(diào)大鼠ASMCs表面瘦素受體表達(dá)來抑制瘦素的促大鼠ASMCs增殖作用，從而改善氣道重塑。

本研究為噻托溴銨應(yīng)用于哮喘提供了新的理論依據(jù)，臨床上，對哮喘患者特別是重癥哮喘患者的治療中聯(lián)合噻托溴銨可能有助于增加療效。

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