鄭神英，李 寧

(1.河北北方學(xué)院，河北張家口075000;2.解放軍總參謀部總醫(yī)院病理科，北京100091)

肺癌和結(jié)直腸癌都是很常見、發(fā)病率很高的惡性腫瘤。肺癌目前是全世界癌癥死因的第1名，其中80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)［1］。結(jié)直腸癌是癌癥死亡的第3大原因，每年幾乎有100萬例的發(fā)病率，無論在男性還是女性［2］。由于很多患者在診斷時已經(jīng)處于中晚期，常規(guī)治療往往不能達(dá)到預(yù)期效果。隨著分子靶向藥物的研發(fā)和個體化治療的發(fā)展，使得癌癥患者的治療有了很大改善，如酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)用。KRAS基因與肺癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，同時KRAS突變是所有腫瘤中突變頻率最高的基因，因此成為研究的焦點(diǎn)。KRAS基因是EGFR的下游因子，若基因發(fā)生突變，則患者不能從酪氨酸激酶抑制劑中獲益。因此KRAS的突變成為靶向治療的關(guān)鍵。本研究用測序法檢測非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌中KRAS的突變情況，研究其與臨床病理特征之間的關(guān)系，并橫向比較KRAS基因突變在兩種癌癥間的異同。

1 材料與方法

1.1 材料:收集解放軍總參謀部總醫(yī)院病理科2010年至2011年間存檔標(biāo)本或新鮮標(biāo)本，其中非小細(xì)胞肺癌112例，結(jié)直腸癌65例。

1.2 KRAS基因突變檢測:所有蠟塊切4 μm厚切片5～10張，顯微鏡下進(jìn)行微切割，富集腫瘤細(xì)胞，石蠟組織充分消化后用Nucleic Acid and Protein Purification試劑盒(MN公司)提取DNA。將提取的基因組DNA應(yīng)用PCR擴(kuò)增法，分別擴(kuò)增KRAS第12、13和61密碼子，引物序列:第12號密碼子上游引物(F):5'-ACCTTATGTGTGACATGTTC-3'，下游引物(R):5'-CTATTGTTGGATCATATTCG-3';第13號密碼子上游引物(F):5'-ACCTTATGTGTGACATGTTC-3'，下游引物(R):5'-CTATTGTTGGATCATATTCG-3';第61號密碼子上游引物(F):5'-TTCCTACAGGAAGCAAGTAG-3'，下游引物(R):5'-CACAAAGAAAGCCCTCCCCA-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用ABI 3730測序儀進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果采用Chromas軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS軟件17.0，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)及Fisher精確概率法評價KRAS基因突變率與潛在影響因素的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌臨床資料:112病例均成功檢測。男性73例，女性39例;年齡28～86歲，中位年齡60歲;有吸煙史患者63例，無吸煙史患者49例;組織學(xué)證實(shí)腺癌70例，非腺癌42例。

2.2 結(jié)直腸癌臨床資料:65例病例均成功檢測。男性36例，女性29例;年齡32～86歲，中位年齡59歲;有吸煙史12例，無吸煙史53例;肝轉(zhuǎn)移7例，無轉(zhuǎn)移58例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無轉(zhuǎn)移47例;脈管浸潤18例，無浸潤47例。

2.3 KRAS基因在非小細(xì)胞肺癌中突變情況:112例患者中檢出11例突變，突變率為9.8%。其中8例為第12密碼子突變，占72.7%;1例為第13密碼子突變，占9.1%;2例為第61密碼子突變，占18.2%。第12密碼子中GGT＞GTT 3例，GGT＞TGT 2例，GGT＞GCT 3例;第13密碼子中GGC＞TGC 1例;第61密碼子CAA＞CAC 1例，CAA＞CTA 1例。

2.4 KRAS基因在結(jié)直腸癌中突變情況:65例患者中檢出19例突變，突變率為29.2%。其中16例為第12密碼子突變，占84.2%;1例為第13密碼子突變，占5.26%;2例為第61密碼子突變，占10.5%。第12密碼子中GGT＞GAT 12例，GGT＞TGT 1例，GGT＞GTT 3例;第13密碼子中GGC＞GAC 1例;第61密碼子CAA＞CGA 2例。

2.5 KRAS基因突變與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系:KRAS突變與患者性別、年齡、吸煙史及腫瘤類型均無明顯關(guān)系(表1)。

2.6 KRAS基因突變與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系:KRAS突變與患者性別、吸煙史、是否肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管浸潤均無明顯關(guān)系，但與患者年齡明顯相關(guān)(P＜0.05)(表2)。

表1 NSCLC組織KRAS突變檢測與臨床參數(shù)的關(guān)系Table 1 The correlation between KRAS mutation and clinical parameter in NSCLC

3 討論

隨著腫瘤個體化治療觀念深入人心，越來越多的基因突變點(diǎn)檢測應(yīng)用于臨床。KRAS突變在肺癌和結(jié)直腸癌中均很常見，其與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、遷移、擴(kuò)散和血管生成均有關(guān)系。KRAS突變和NSCLC不良預(yù)后有關(guān)，是一個獨(dú)立于分期影響生存的因素［3］。KRAS是EGFR下游的重要分子，KRAS突變和EGFR突變相互排斥，與原發(fā)性EGFR-TKIs耐藥相關(guān)。

對于KRAS基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系尚沒有達(dá)成一致，而且相關(guān)報道也不盡相同。KRAS基因突變在肺腺癌中與男性和吸煙有關(guān)。KRAS突變與吸煙史有關(guān)，且突變率隨著吸煙暴露史的增加而升高。但在本次檢測中沒有發(fā)現(xiàn)肺癌中KRAS基因突變與吸煙有關(guān)。KRAS基因在結(jié)直腸癌大于60歲女性人群中突變率較高。KRAS基因突變與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本次對結(jié)直腸癌的檢測中，僅發(fā)現(xiàn)與年齡相關(guān)，分析可能與病例較少有關(guān)。

表2 結(jié)直腸癌組織KRAS突變檢測與臨床參數(shù)的關(guān)系Table 2 The correlation between KRAS mutation and clinical parameter in colorectal cancer

綜上，結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變率比肺癌患者高。無論在肺癌還是結(jié)直腸癌中，KRAS基因突變都以第12密碼子為主。結(jié)直腸癌中KRAS突變與年齡相關(guān)。KRAS基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系尚需更多的研究來進(jìn)一步確定。

［1］李雪，李建鵬，哈鵬文．Stathmin在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)增強(qiáng)［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:1115 －1119．

［2］Sergio R，Giuseppe B，Daniele F，et al．Prognostic vs predictive molecular biomarkers in colorectal cancer:is KRAS and BRAF wild type status required anti-EGFR therapy［J］．Cancer Treat Rev，2010，36:S56 － S61．

［3］付鮮花，黃建瑾．非小細(xì)胞肺癌中KRAS基因突變最新臨床意義［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30:212 －214．