宋曉暉，陳洪鎖，孫雅楠，張?jiān)气?，?芳，陳 婧，趙嘉銀，李 洪綜述，趙 臣審校 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.0級臨床醫(yī)學(xué)專升本班，.00級臨床醫(yī)學(xué)本科班甲班，3.血液檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 303)

白血病是一類造血干細(xì)胞的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細(xì)胞因不能進(jìn)一步分化成熟而停滯在血細(xì)胞發(fā)育的不同階段，使正常的造血功能受到抑制引起血細(xì)胞減少。臨床上出現(xiàn)不同程度的貧血、感染、發(fā)熱、出血和肝、脾、淋巴結(jié)腫大等癥狀。

最新的流行病學(xué)研究顯示，我國白血病發(fā)病率為5.17/10萬，兒童及35歲以下成人的死亡率位居惡性腫瘤死亡率的第一位，可見白血病是危害人類主要的惡性腫瘤之一。傳統(tǒng)的放療或化療具有一定的治療作用，也是目前臨床采用的主要治療方法。但其在殺死白血病細(xì)胞的同時(shí)，也殺死了體內(nèi)的正常細(xì)胞。中性粒細(xì)胞數(shù)目的減少易導(dǎo)致感染而嚴(yán)重影響白血病的治療效果。如果能讓白血病病人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)識別腫瘤細(xì)胞繼而抑制其繁殖，那么腫瘤細(xì)胞就無法逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，從而使高危的急性白血病(acute leukemia，AL)患者產(chǎn)生針對腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)，提高其長期生存率。研究表明［1］，白血病疫苗能激活一系列免疫增強(qiáng)反應(yīng)，使免疫系統(tǒng)能夠識別并清除白血病細(xì)胞，取得了很好的治療效果。

目前，在研的白血病疫苗包括白血病細(xì)胞疫苗、白血病相關(guān)多肽疫苗、樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DC)疫苗和DNA疫苗，部分疫苗已經(jīng)進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)階段?，F(xiàn)將各種白血病疫苗的臨床應(yīng)用進(jìn)展做如下綜述。

1 白血病細(xì)胞疫苗

白血病細(xì)胞疫苗是將白血病細(xì)胞進(jìn)行基因修飾使其表達(dá)MHC分子以增強(qiáng)其免疫原性，通過表達(dá)細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)以吸引DC，使其捕獲、加工和提呈腫瘤抗原。在一個Ⅰ期臨床試驗(yàn)中用編碼CD40L的復(fù)制缺陷腺病毒(Ad-CD40L)轉(zhuǎn)導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)細(xì)胞后輸給CLL病人，觀察到重組腺病毒相關(guān)病毒(Recombinant adeno associated virus，rAAV)，證實(shí)初級B細(xì)胞CLL細(xì)胞可被轉(zhuǎn)導(dǎo)，也可針對突變體為CLL細(xì)胞進(jìn)行定向性選擇［2］。同理，AL細(xì)胞疫苗的研究是可行的。白血病細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化成DC，能有效地刺激T細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答［3-4］。有研究［5］顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)了自體CD154的白血病細(xì)胞作為細(xì)胞疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果良好，該疫苗不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫，還可以通過誘導(dǎo)Fas(CD95)依賴的細(xì)胞凋亡來直接促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于無需鑒定腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)。同時(shí)，由于它包含了腫瘤細(xì)胞的所有抗原，可以激活不同的前體T細(xì)胞，因此可誘導(dǎo)全面的免疫反應(yīng)，在理論上降低了腫瘤免疫逃避，但它同時(shí)也增加了誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的可能。有學(xué)者將滅活的自身白血病細(xì)胞與IL-2、IL-6、GM-CSF聯(lián)合制備的白血病疫苗應(yīng)用到29例復(fù)發(fā)或者難治性AL患者中，其中5例完全緩解(complete remission，CR)，6例部分緩解［6］。為進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞疫苗的安全性，在一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期自身氧化腫瘤細(xì)胞疫苗試驗(yàn)中，18例CLL早期患者中有5例受試患者產(chǎn)生了與體外增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞活性相關(guān)的部分臨床反應(yīng)，有6例受試患者病情保持穩(wěn)定，其余受試患者病情不受影響，且毒副作用較?。?］。雖然可以通過多種方法增強(qiáng)白血病細(xì)胞疫苗的免疫原性，但對于每一個特定的白血病細(xì)胞疫苗還需要通過研究嘗試以篩選出合適的方法，使該疫苗達(dá)到最佳的免疫治療效果。

2 白血病相關(guān)多肽疫苗

抗原肽可直接刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，而無自身免疫反應(yīng)或免疫抑制。普通的多肽抗原因其分子量小、缺乏多個表位、易被降解而使其免疫原性降低、易被機(jī)體代謝消化、可引起免疫耐受等缺點(diǎn)。研究表明BCR-ABL(breakpoint cluster region，BCR)融合蛋白［8］、WT1蛋白［9］和蛋白水解酶-3因在絕大多數(shù)白血病細(xì)胞中高表達(dá)，而很少在正常細(xì)胞中表達(dá)，是疫苗治療的理想靶點(diǎn)，因此其制備的疫苗能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)反應(yīng)，達(dá)到清除白血病細(xì)胞的目的。

CD8+T能夠與天然的BCR-ABL肽段發(fā)生交叉反應(yīng)，從而更有效地激發(fā)機(jī)體的抗白血病免疫。因此，研究人員一直在努力尋找CD8+T細(xì)胞抗原表位BCR-ABL融合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+Th細(xì)胞通過識別與HLA-Ⅱ類分子結(jié)合的氨基酸多肽并產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，使其直接加強(qiáng)和維持CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)DC也發(fā)揮了間接免疫作用。Cath-cart等［10］用b3a2肽進(jìn)行了Ⅱ期臨床試驗(yàn)，被注射了b3a2肽的14例慢性期慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)患者，都出現(xiàn)了CD4+免疫應(yīng)答。其中，Ph+細(xì)胞百分比顯著下降的患者有4例，異基因干細(xì)胞復(fù)發(fā)者一過性PCR結(jié)果轉(zhuǎn)陰的患者有3例。為驗(yàn)證BCR-ABL融合肽疫苗的安全性，Pinilla Ibarz等［11］在12例CML慢性期成人患者體內(nèi)進(jìn)行了測試，注射BCR-ABL疫苗的受試者都能較好地耐受并未表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，其中6位受試者接受兩種高劑量的疫苗，有3例出現(xiàn)了T細(xì)胞增殖反應(yīng)且維持至接種疫苗5個月之后。雖然BCR-ABL肽能夠誘發(fā)CD4+T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答，但CD8+T細(xì)胞應(yīng)答則不穩(wěn)定，鑒于此Pinilla Ibarz等［12］針對CML的BCR-ABL基因融合點(diǎn)(p210/b3a2或p210/b2a2)的連接序列，設(shè)計(jì)合成了與天然肽結(jié)構(gòu)類似的抗原肽來誘發(fā)更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，其產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞能夠與天然的BCR-ABL肽段發(fā)生交叉反應(yīng)，從而使機(jī)體的抗白血病免疫反應(yīng)強(qiáng)烈且有效。WT1多肽的研究已廣泛用于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)。受試患者體內(nèi)出現(xiàn)WT1-CD8+T細(xì)胞和WT1mRNA表達(dá)水平下降，說明疫苗使身體產(chǎn)生抗白血病反應(yīng)［13-14］。Oka等［15］對26例白血病患者進(jìn)行WTl基因編碼多肽制備的疫苗治療，有半數(shù)出現(xiàn)了白血病原始細(xì)胞減少、腫瘤縮小、正常組織沒有受到損害。說明多肽疫苗安全有效，能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫及臨床應(yīng)答，也可預(yù)防白血病的復(fù)發(fā)。

3 DC疫苗

DC疫苗是對DC進(jìn)行體外誘導(dǎo)或經(jīng)過基因修飾以增強(qiáng)其提呈腫瘤抗原的能力，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤免疫作用。將腫瘤細(xì)胞與DC融合，可使腫瘤細(xì)胞上的全部抗原提供給DC，即可針對廣泛的腫瘤抗原決定簇產(chǎn)生免疫反應(yīng)。將DC-腫瘤融合細(xì)胞疫苗注入體內(nèi)激發(fā)其腫瘤特異的CTL，產(chǎn)生抗腫瘤免疫，可預(yù)防腫瘤播散和復(fù)發(fā)以治療腫瘤。細(xì)胞因子可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化成DC樣細(xì)胞，將腫瘤抗原基因直接轉(zhuǎn)入DC則可更有效地向DC提供抗原。通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，在DC的骨髓前體細(xì)胞中導(dǎo)入腫瘤抗原或細(xì)胞因子的基因以制備疫苗，其在動物實(shí)驗(yàn)中可誘導(dǎo)抗原產(chǎn)生特異的CTL反應(yīng)，避免誘發(fā)自身免疫性疾病的危險(xiǎn)。目前已經(jīng)研究出的DC疫苗主要有抗原負(fù)載DC疫苗［16］、基因修飾DC疫苗［17］、白血病細(xì)胞來源的DC疫苗［18］、DC腫瘤融合細(xì)胞疫苗［17］等。

孫黎飛［19］等研究，用IL-2基因修飾DC，能促進(jìn)DC自身分泌高水平IL-2、TNF-γ和IL-12，機(jī)體能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖和活化，優(yōu)化抗原提呈的微環(huán)境，增強(qiáng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。為減少基因?qū)隓C的無效率和毒性，學(xué)者將DC與腫瘤抗原的mRNA共同孵育，以此制備的疫苗可以誘導(dǎo)CTL活性和保護(hù)性免疫的產(chǎn)生，為腫瘤的免疫治療提供了一個新的選擇。2003年Li等［20］從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離出總RNA，再將其負(fù)載于DC，注入DC/RNA疫苗的幼稚小鼠能夠使部分小鼠在受到致死劑量的L615細(xì)胞攻擊時(shí)產(chǎn)生保護(hù)作用，使白血病發(fā)生率下降，患者總存活期延長。

因腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物包括了腫瘤細(xì)胞的所有抗原，則有誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的可能。目前，此類疫苗在研究中需要解決的問題是如何同時(shí)有效地增強(qiáng)針對腫瘤抗原的特異性免疫應(yīng)答，并盡可能地避免自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。

4 DNA疫苗

核酸疫苗的出現(xiàn)推動了疫苗的發(fā)展。核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導(dǎo)入動物體細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。DNA疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后被組織細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞或其他炎性細(xì)胞等攝取，使蛋白質(zhì)抗原在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫［21-22］。核酸疫苗的免疫保護(hù)力強(qiáng)、應(yīng)用較安全，接種核酸疫苗后，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)抗原不會引起機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)。核酸疫苗的質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，制備簡單，省時(shí)省力，貯存、運(yùn)輸方便。產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答、可用于防治腫瘤CTL，從而為癌癥的預(yù)防和免疫治療提供了新的方向。

4.1 DNA疫苗

DNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，是一種前景廣闊的新型疫苗，目前已經(jīng)在多種病毒或寄生蟲等［23-25］感染性疾病的免疫預(yù)防中起到了積極作用。白血病相關(guān)DNA疫苗主要有融合基因DNA疫苗［26］、獨(dú)特型DNA疫苗［27］等。其佐劑效應(yīng)表現(xiàn)在DNA疫苗載體本身的甲基化胞苷磷酸鳥苷(CpG)序列，對誘導(dǎo)抗原特異性免疫起重要作用，但在大型動物體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答還較微弱。除常規(guī)的用以顯著增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果佐劑以外，還有多肽佐劑和基因佐劑。例如，在接種DNA疫苗的同時(shí)給予某些細(xì)胞因子，或?qū)⒓?xì)胞因子的基因與腫瘤抗原基因連接克隆到同一載體構(gòu)建成雙表達(dá)載體，以增強(qiáng)免疫作用［28］。

融合基因DNA疫苗是染色體易位形成的某些融合基因，直接參與白血病的發(fā)生，該基因只在白血病細(xì)胞中表達(dá)，而不表達(dá)于正常細(xì)胞中。Padua［26］將人類早幼粒細(xì)胞白血病的PML-RARα融合基因與破傷風(fēng)毒素基因的c段序列融合，針對小鼠早幼粒細(xì)胞白血病模型設(shè)計(jì)出一種DNA疫苗，首次證實(shí)以融合蛋白為特異性靶點(diǎn)的DNA疫苗單獨(dú)或者與全反式維甲酸聯(lián)用時(shí)，患病動物的生存率有顯著提高，同時(shí)體內(nèi)出現(xiàn)時(shí)間依賴的抗體和INF-γ的增加。

獨(dú)特型DNA疫苗是淋巴系統(tǒng)腫瘤表面表達(dá)的獨(dú)特型免疫球蛋白，可以作為腫瘤相關(guān)抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答［24］。Pasquini等［29］制備了兩種針對細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的B細(xì)胞獨(dú)特型的疫苗，分別采用了質(zhì)粒載體和痘苗病毒載體，均表達(dá)了白血病特異的免疫球蛋白重鏈互補(bǔ)決定區(qū)來源的多肽。結(jié)果為接受兩種疫苗免疫的小鼠受到白血病細(xì)胞攻擊后生存率較對照組明顯延長。核酸疫苗的動物實(shí)驗(yàn)的成功為MRL的治療帶來了新的希望。

4.2 DNA疫苗佐劑

DNA疫苗可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，但在人體內(nèi)的效力卻不盡如人意，因此需要增強(qiáng)DNA疫苗在人體內(nèi)的免疫效果。免疫佐劑可通過其與APC表面受體的特異性結(jié)合而有加快APC攝取DNA疫苗的效率，有利于抗原提呈，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在利用PML-RARα融合基因制備的針對小鼠早幼粒細(xì)胞白血病模型的研究中，Padua［26］等采用破傷風(fēng)毒素基因的c片段作為佐劑獲得了滿意的效果。最新研究發(fā)現(xiàn)，Pollock［30］將編碼巨噬細(xì)胞集落刺激因子和CD40-L的基因連接到相應(yīng)載體中作為佐劑，同樣產(chǎn)生了理想的療效。

5 結(jié)語

目前白血病疫苗的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展，白血病細(xì)胞疫苗和相關(guān)多肽疫苗已有部分進(jìn)入了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，并具有良好的研究和應(yīng)用前景，但目前仍有HLA限制性肽疫苗免疫原性弱、接種的濃度和接種的時(shí)間以及進(jìn)一步消除自身免疫反應(yīng)等許多問題有待于解決，所以距離臨床應(yīng)用還有一定的距離。尋找白血病相關(guān)抗原和特異抗原、增強(qiáng)疫苗的免疫原性、克服免疫耐受等將是今后研究的目標(biāo)，因此核酸疫苗在白血病的治療和預(yù)防當(dāng)中將起到舉足輕重的作用?？傊?，白血病的預(yù)防與治療任重而道遠(yuǎn)，各種疫苗的開發(fā)和應(yīng)用將是今后這一領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

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