王海波，于紅博 (.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 吉林 303;.吉林市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 吉林 3000)

在檢驗(yàn)工作中可觀察到少數(shù)樣本血清HBsAg和抗-HBs同時(shí)陽(yáng)性的現(xiàn)象，給檢驗(yàn)結(jié)果解釋和臨床診斷帶來(lái)一定的困惑。本研究分析同時(shí)陽(yáng)性樣本中HBsAg和抗-HBs的體外特性。

1 材料、方法與結(jié)果

1.1 樣本來(lái)源

在日常工作中，應(yīng)用全自動(dòng)免疫發(fā)光檢測(cè)技術(shù)在血清HBsAg陽(yáng)性樣本中收集到1例抗-HBs陽(yáng)性的血清樣本;收集20例血清HBsAg陽(yáng)性并且血清抗-HBs陰性的樣本，每例樣本血清用生理鹽水調(diào)整HBsAg至相近濃度;收集20例血清HBsAg陰性并且血清抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc陽(yáng)性的樣本，每例樣本血清用生理鹽水調(diào)整抗-HBs至相近濃度。

1.2 主要儀器與試劑

Multiskan MK3酶標(biāo)儀(上海雷勃生物技術(shù)有限公司);Fluo Cycle型核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品);化學(xué)發(fā)光儀(日本東曹AIA-1800ST)。

乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量檢測(cè)試劑盒(日本東曹);乙型肝炎病毒(HBV)基因分型檢測(cè)試劑(上?？迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品);乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)確認(rèn)試劑盒(中和試驗(yàn)法)(珠海麗珠試劑股份有限公司);HbsAg亞型檢測(cè)試劑(上海科華生物工程股份有限公司產(chǎn)品)。

1.3 血清學(xué)標(biāo)志物的測(cè)定

運(yùn)用化學(xué)發(fā)光定量方法按儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。進(jìn)行HBV五項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、HBeAb、HBcAb)的定量檢測(cè)。

1.4 血清學(xué)中和反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)樣本各反應(yīng)物濃度的配制:根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用生理鹽水調(diào)控雙陽(yáng)性樣本的HBsAg濃度為4.5μg/L;雙陽(yáng)性樣本的抗-HBs濃度利用原始濃度為50.60 IU/L;用生理鹽水調(diào)控20例HBsAg單陽(yáng)性樣本的濃度為810μg/L左右;用生理鹽水調(diào)控20例抗-HBs單陽(yáng)性樣本的濃度為640 IU/L左右。

雙陽(yáng)性樣本中HBsAg的中和試驗(yàn):參照［1］HBsAg與抗-HBs體外中和反應(yīng)比例，在抗-HBs過(guò)量情況下，向已經(jīng)編號(hào)的20支試管中各加入HBsAg已經(jīng)調(diào)控為4.5μg/L左右的雙陽(yáng)性標(biāo)本0.2 mL，向每個(gè)試管中分別加入0.2 mL上述抗-HBs單陽(yáng)性的樣本，充分混勻，37℃孵育，孵育過(guò)程中不時(shí)搖勻以進(jìn)行HBsAg與抗-HBs體外中和反應(yīng)。2 h后，測(cè)定每個(gè)試管中的中和物的HBsAg含量。記錄定量結(jié)果。取1例HBsAg單陽(yáng)性樣本0.2 mL代替雙陽(yáng)性樣本的HBsAg做對(duì)照組平行分析。記錄各組結(jié)果。

雙陽(yáng)性樣本中抗-HBs的中和試驗(yàn):參照［1］HBsAg與抗-HBs體外中和反應(yīng)比例，在HBsAg過(guò)量情況下，向已經(jīng)編號(hào)的20支試管中各加入抗-HBs原始濃度的雙陽(yáng)性標(biāo)本0.2 mL，向每個(gè)試管中分別加入0.2 mL上述已經(jīng)調(diào)控為810μg/L左右濃度的HBsAg單陽(yáng)性的樣本，充分混勻，37℃孵育，孵育過(guò)程中不時(shí)搖勻以進(jìn)行HBsAg與抗-HBs體外中和反應(yīng)。2 h后，測(cè)定每個(gè)試管中的中和物的抗-HBs含量。記錄定量結(jié)果。取1例抗-HBs單陽(yáng)性樣本0.2 mL代替雙陽(yáng)性樣本的抗-HBs做對(duì)照組平行分析。記錄各組結(jié)果。

1.5 測(cè)定樣本的HBV基因型和HBsAg亞型

HBV基因型測(cè):采用上?？迫A生物科技有限公司血清DNA抽提試劑盒，按上?？迫A生物科技有限公司血清DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用濃縮裂解法提取血清HBV DNA。取2μL提取液為模板做PCR擴(kuò)增，按照文獻(xiàn)介紹型特異性引物分型法［2］，利用巢式PCR技術(shù)對(duì)提取的血清HBV DNA進(jìn)行基因分型，記錄各組測(cè)定結(jié)果。

HBsAg亞型的測(cè)定:外送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)定。

1.6 判斷標(biāo)準(zhǔn)

化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)技術(shù)測(cè)定的血清學(xué)標(biāo)志物按說(shuō)明書(shū)判斷陰陽(yáng)性結(jié)果來(lái)設(shè)定正常參考范圍，即:HBsAg大于0.06μg/L為陽(yáng)性，抗-HBs大于6.5 IU/L為陽(yáng)性;HBV基因分型根據(jù)HBV全基因核苷酸序列異源性≥8%或者S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%將不同病毒株分為不同的基因型，迄今為止，HBV可以分為8個(gè)基因型，即A、B、C、D、E、F、G和H型。

1.7 結(jié) 果

從2 566例日常檢測(cè)中，獲取1例HBsAg和抗-HBs雙陽(yáng)性樣本:HBsAg為130.21μg/L、抗-HBs為50.60 IU/L，HBV基因型為B型，HBsAg亞型為adw;獲取20例HBsAg單陽(yáng)性樣本，HBsAg濃度大于800μg/L;獲取20例抗-HBs單陽(yáng)性伴隨抗HBe和抗-HBc陽(yáng)性樣本，抗-HBs濃度大于600 IU/L。

雙陽(yáng)性樣本中HBsAg的中和試驗(yàn)結(jié)果表明，20例不同來(lái)源的抗-HBs體外均能中和雙陽(yáng)性樣本中的HBsAg;雙陽(yáng)性樣本中抗-HBs的中和試驗(yàn)結(jié)果表明，20例不同來(lái)源的HBsAg單陽(yáng)性樣本中，有6例能中和雙陽(yáng)性樣本中的抗-HBs(中和物抗-HBs濃度小于6.5 IU/L)。雙陽(yáng)性樣本中HBsAg和抗-HBs的體外中和反應(yīng)有顯著性差異(P＜0.01)

2 討論

HBV基因組全長(zhǎng)3 215 bp，含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架，分別為S、C、P和X區(qū)，S基因編碼HBV前S1、前S2和主蛋白，病毒在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的HBsAg不僅包被病毒基因組，更有過(guò)量表達(dá)的HBsAg釋放到血液中。HBsAg具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)性作用的抗-HBs。

HBsAg和抗-HBs的中和反應(yīng)是機(jī)體免疫乙肝病毒的基礎(chǔ)。當(dāng)HBsAg誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗-HBs時(shí)，在同一機(jī)體內(nèi)環(huán)境下，兩者會(huì)連續(xù)進(jìn)行特異性中和反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)離體血清學(xué)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HBsAg過(guò)量時(shí)，只能檢出HBsAg，當(dāng)抗-HBs大量產(chǎn)生時(shí)，體外只能檢出抗-HBs。但在臨床實(shí)踐中，可觀察到HBsAg/抗-HBs同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性的現(xiàn)象，多見(jiàn)于慢性HBV感染者。

本研究是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間收集血清，最終獲得1例慢性乙肝患者血清，化驗(yàn)復(fù)核后證實(shí)為HBsAg陽(yáng)性，同時(shí)抗-HBs亦為陽(yáng)性?？?HBs均檢測(cè)2次以上，并應(yīng)用了不同廠家、不同檢測(cè)生產(chǎn)的抗-HBs檢測(cè)試劑盒核實(shí)無(wú)誤。

抗-HBs產(chǎn)生有下列兩方面的因素可以誘導(dǎo):①接種乙肝疫苗后，獲得了免疫力，是一種好現(xiàn)象;②乙肝恢復(fù)期或曾患乙肝已愈，表示已有免疫力。機(jī)體未接種過(guò)乙肝疫苗具有的抗-HBs是機(jī)體隱性感染乙肝病毒引起機(jī)體產(chǎn)生的抗體，屬野生型抗體，具有型的特異性，此時(shí)機(jī)體內(nèi)往往同時(shí)存在抗-HBe和抗-HBc。20例來(lái)自不同個(gè)體的野生型抗-HBs分別與本研究雙陽(yáng)性樣本中的HBsAg反應(yīng)體外全部完全中和。雙陽(yáng)性樣本中的HBsAg是普通流行的野生型。

HBsAg有4種亞型(adr、adw、ayw、ayr)，有較明確的地理和民族分布特征，具有流行病學(xué)意義。據(jù)報(bào)道，我國(guó)主要存在adr、adw、和ayw三種亞型，北方以adr亞型為主，南方以adw亞型為主，新疆、西藏和內(nèi)蒙古等少數(shù)民族居住地區(qū)以ayw亞型為主［3］。20例來(lái)自不同個(gè)體的野生型HBsAg分別與本研究雙陽(yáng)性樣本中的抗-HBs反應(yīng)，體外6例能完全中和(被中和)抗-HBs，14例無(wú)反應(yīng)。雙陽(yáng)性樣本中的抗-HBs只能與部分野生株HBsAg進(jìn)行特異性中和反應(yīng)。同時(shí)陽(yáng)性樣本中的抗-HBs不是與其共存的HBsAg的特異性抗體，在體內(nèi)不發(fā)生特異性中和反應(yīng)，體外血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)呈同時(shí)陽(yáng)性。

綜上所述，HBsAg和抗-HBs同時(shí)陽(yáng)性樣本中，機(jī)體內(nèi)HBsAg是普通流行的野生型HBsAg，抗-HBs與機(jī)體隱性感染產(chǎn)生的野生型抗-HBs在體外血清學(xué)中和反應(yīng)的范圍有顯著性差異，該抗-HBs是針對(duì)某種HBV基因型的特異性有效保護(hù)性抗體，與機(jī)體本身攜帶的HBsAg無(wú)特異性關(guān)系。

［1］ 滕 龍.HBsAg與HBsAb中和比的研究及應(yīng)用探討［J］.醫(yī)學(xué)研究通訊，2005(6):17-20.

［2］ Naito H，Hayashi S，Abe K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers［J］.J Clin Microbiol，2001，39(1):362-364.

［3］ 董 梅，張躍新.乙型肝炎病毒基因型分布及臨床意義［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(1):56-57.