汪君民，龔騰云

(南通大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通226007)

視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)主要是由脂肪細(xì)胞 分泌的，是特異性結(jié)合視黃醇的蛋白質(zhì)中的一類[1]。研究發(fā)現(xiàn)，RBP4這一脂肪因子會(huì)導(dǎo)致胰島素抗性，對(duì)胰島素抗發(fā)展起到一個(gè)關(guān)鍵作用，在具有胰島素抗性的小鼠體內(nèi)及肥胖、2型糖尿病病人體內(nèi)，血清RBP4的水平升高［2］。升高的RBP4水平與心血管危險(xiǎn)因子關(guān)系密切，并且可用來作胰島素抵抗程度的評(píng)價(jià)［3］。研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低不同年齡階段的研究對(duì)象的RBP4水平［3，4］，提示運(yùn)動(dòng)可以通過RBP4水平的降低來提高胰島素的敏感性。

已有很多研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗可導(dǎo)致高血壓患者紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶的活性減低，而有關(guān)胰島素抵抗對(duì)心臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶影響的研究卻不多，對(duì)于運(yùn)動(dòng)影響心肌細(xì)胞膜這兩種酶變化狀況更是未見報(bào)道，對(duì)胰島素抵抗大鼠的淋巴細(xì)胞凋亡方面也缺乏研究。

本文采用重組RBP4注射活體大鼠，獲得高RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型，觀察運(yùn)動(dòng)后胰島素抵抗和各指標(biāo)變化，為臨床控制胰島素抵抗及糖尿病、心血管并發(fā)癥以及提高胰島素抵抗或糖尿病患者免疫功能提供新的思路。

1 研究材料與方法

1.1 材料

胰島素(Sigma-Aldrich)、2-Deoxy-D-［I-3H］-glucose(Sigma-Aldrich)、RBP4ELISA試劑盒(Biosource)、胰島素放射免疫試劑盒(Biogenesis)、重組RBP4(Alexis)、鼠GM-CSF ELISA試劑盒、淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G250蛋白測(cè)定試劑盒、ATP酶測(cè)試盒、凋亡細(xì)胞試劑盒均購自廈門慧嘉生物技術(shù)公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，流式細(xì)胞儀(FCM)(Beckman Coulter)等儀器。操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 重組RBP4注射與運(yùn)動(dòng)方案

雄性SD大鼠8周齡22只，體重183～211g，隨機(jī)分成RBP4+運(yùn)動(dòng)組(RE)10只、RBP4安靜組(RR)6只，2組大鼠給予重組RBP4腹腔注射［2］，3μg/g體重，每12小時(shí)一次，持續(xù)注射4周。其余6只為正常安靜對(duì)照組(C)。RE組大鼠按照Ploug方法［5］進(jìn)行游泳訓(xùn)練4周，泳池為直徑53cm內(nèi)壁光滑的塑料桶，水深70cm，水溫為35±2℃，游泳訓(xùn)練開始時(shí)間為晚上6點(diǎn);大鼠先進(jìn)行每天15分鐘適應(yīng)性游泳訓(xùn)練共2天，從第3天開始采取每天無負(fù)重游泳，每次持續(xù)60min，每周訓(xùn)練6天，周日休息，共持續(xù)4周。訓(xùn)練中，大鼠如出現(xiàn)反復(fù)下沉或溺水傾向，及時(shí)撈出，休息后片刻，再投入水中，直至補(bǔ)足60min訓(xùn)練時(shí)間;同時(shí)使用小木棍及時(shí)驅(qū)趕，使大鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)，避免其出現(xiàn)抱團(tuán)、漂浮等現(xiàn)象，保證訓(xùn)練效果。將正常安靜對(duì)照組大鼠在浸水后撈出。游泳結(jié)束后撈出，以干毛巾擦拭，暖風(fēng)機(jī)吹干。

1.2.2 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)的檢測(cè)

采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定RBP4;采用放射免疫分析法測(cè)定胰島素。采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法評(píng)價(jià)胰島素敏感性，其原理是:假設(shè)外周組織和肝臟的胰島素抵抗相等，按胰島素和血葡萄糖在周圍組織、肝和胰腺等器官相互影響而建立起來的數(shù)學(xué)模型。模型的計(jì)算公式為:HOMA-IR(胰島素抵抗指數(shù))=空腹胰島素(國際單位/L)×以空腹葡萄糖(mmoL/L)/22.5。

1.2.3 心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性檢測(cè)

無菌取出心臟，PBS洗去血液。去外膜后用眼科剪將其剪成1 mm3大小的組織塊，稱重約0.2 g心室肌與預(yù)冷的勻漿介質(zhì)1∶9混合(勻漿介質(zhì)組成:Tris1·21g/L、EDTA-Na237·23 mg/L、蔗糖34·2 g/L、再以HCl滴定至pH值為7·4)，在玻璃勻漿器中研磨制成10%的混懸液，以3 000 r/min離心10 min，取上清液(即心肌勻漿)放置-20℃冰箱中低溫保存。檢測(cè)時(shí)，1 ml生理鹽水清洗細(xì)胞3次，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，1000r/min離心5 min，用生理鹽水將細(xì)胞打成懸液，混勻后，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，然后按照Na+-K+-ATP酶測(cè)試盒說明書(化學(xué)比色法)要求測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。Ca2+-ATP酶活性與此類似。

1.2.4 大鼠血清中GM-CSF水平檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗鼠GM-CSF單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的GM-CSF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人GM-CSF，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測(cè)OD值，GM-CSF濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中GM-CSF濃度。

1.2.5 免疫學(xué)指標(biāo)

CD4、CD8的活性測(cè)定用S-P一步法;均參照試劑盒說明書進(jìn)行操作;胸腺及脾臟指數(shù):用分析天平稱取胸腺及脾臟重量后，計(jì)算依據(jù)下列公式:胸腺(或脾臟)指數(shù)(g/100g)=100×胸腺(或脾臟)重量/體重。

1.2.6 胸腺細(xì)胞凋亡光鏡觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死動(dòng)物，取出胸腺進(jìn)行凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記及觀察。采用TUNEL方法［6］:將制備的胸腺組織石蠟切片脫蠟、乙醇水化，PBS沖洗后蛋白酶K消化，TDT酶/生物素-dUTP反應(yīng)液等處理(具體步驟按試劑盒說明進(jìn)行)，最后二甲苯透明，樹膠封固，顯微鏡下觀察結(jié)果并攝像。陽性標(biāo)準(zhǔn)為核呈棕紅色、背景清晰。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0程序處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，由于HOMA-IR為非正態(tài)分布，經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行分析。組間進(jìn)行方差分析，相關(guān)分析采用簡(jiǎn)單相關(guān)。采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)變化

4周后，RE組和RR組大鼠血清RBP4水平顯著高于C組(P＜0.01);RE組大鼠血清RBP4水平顯著低于RR組(P＜0.01);RE組和RR組大鼠HOMA-IR顯著高于C組(P＜0.01);RE組大鼠HOMA-IR顯著低于RR組(P＜0.01)(見表1)。

表1 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)變化

2.2 大鼠心肌Na+－K+－ATP酶和Ca2+ATP酶活性

表2 大鼠心肌Na+－K+－ATP酶和Ca2+－ATP酶活性

2.3 大鼠血清中GM－CSF水平變化

表3 大鼠血清中GM－CSF水平

2.4 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值變化

表4 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值變化

4周后，RR組和C組大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值差異不大;RE組大鼠外周血CD4活性明顯高于RR組(P＜0.05)，而CD8活性明顯低于RR組(P＜0.05);其比值高于RR組(P＜0.01)。

2.5 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化

表5 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化

4周后，RR組與C組大鼠相比，體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)都有所下降(P＜0.05);而RE組與C組大鼠相比體重?zé)o顯著差異，與RR組比胸腺指數(shù)(P＜0.05)、脾臟指數(shù)明顯提高(P＜0.01)。

圖1 各組胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)光鏡下細(xì)胞凋亡情況

2.6 觀察大鼠胸腺細(xì)胞凋亡的數(shù)量及分布部位

正常安靜對(duì)照組(C):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位均能見被著染成棕紅色的凋亡細(xì)胞，陽性細(xì)胞占整個(gè)胸腺細(xì)胞比例較少。

RBP4安靜組(RR):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見棕紅色的凋亡細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增多，陽性細(xì)胞占整個(gè)胸腺細(xì)胞的比例增大。

RBP4+運(yùn)動(dòng)組(RE):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見棕紅色的凋亡細(xì)胞似較正常安靜對(duì)照組增多，但較RBP4安靜組明顯減少。

3 討論

3.1 大鼠血清RBP4變化情況

胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，還是代謝綜合征(糖尿病、肥胖、高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病)的共同的病理基礎(chǔ)。胰島素能夠提高組織對(duì)葡萄糖的攝取率，機(jī)制是胰島素與靶細(xì)胞的胰島素信號(hào)蛋白相互作用，最終能夠增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體從細(xì)胞內(nèi)池向細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)［7］。胰島素在不同的組織、細(xì)胞中通過復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大作用發(fā)揮不同的生理作用。本研究中大鼠經(jīng)過RBP4注射4周后，與C組相比，RE組和RR組大鼠均出現(xiàn)胰島素抵抗;對(duì)RBP4注射后的大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，雖然大鼠血清RBP4水平仍高C組，但與RR組比明顯下降。與此對(duì)應(yīng)的是:RE組和RR組大鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著高于C組，RE組大鼠明顯低于RR組。說明運(yùn)動(dòng)能夠抵抗RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

3.2 大鼠心肌Na+－K+－ATP酶和Ca2+－ATP酶活性

Na+-K+-ATP酶又稱鈉泵。該酶可水解ATP釋放能量逆電化學(xué)梯度實(shí)現(xiàn)Na+和K+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，把動(dòng)作電位去極相進(jìn)入胞漿的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，把復(fù)極相流出的K+運(yùn)回胞內(nèi)。正常狀態(tài)下胰島素直接作用于血管平滑肌或刺激血管內(nèi)皮釋放NO，激活Na+-K+-ATP酶，促進(jìn)Na+-H+交換，使細(xì)胞膜超極化，Ca2+通道關(guān)閉，從而介導(dǎo)糖攝取和血管舒張。但隨著胰島素抵抗程度加深和/或內(nèi)皮功能障礙的加重，血管活性物質(zhì)(包括胰島素)作用力相對(duì)降低，導(dǎo)致內(nèi)皮eNOS表達(dá)及活性降低，NO介導(dǎo)的血管擴(kuò)張受損［8］。內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷可通過改變胰島素受體的表達(dá)或功能，以影響葡萄糖的清除而參與胰島素抵抗的發(fā)生。

Na+-K+-ATP酶對(duì)胰島素敏感，當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞上的Na+-K+-ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+增加，血管壁對(duì)升壓物質(zhì)的反應(yīng)性增加［9］。Smith等［10］認(rèn)為Na+-K+-ATP酶活性變化不因糖尿病的細(xì)胞代謝障礙引起，而是由上皮因子和胰島素等引起酶的調(diào)節(jié)改變所致。Pollock CA等［11］應(yīng)用電子微探頭X射線分析技術(shù)測(cè)量STZ誘導(dǎo)的SD大鼠早期糖尿病腎病的各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)Na+明顯增加，腎小球?yàn)V過率明顯高于正常安靜對(duì)照組，認(rèn)為糖尿病腎病高濾過期時(shí)近端小管的Na+-K+-ATP酶活性增加。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):心肌Na+-K+-ATP酶活性在RE組較RR組明顯升高，與糖尿病早期的結(jié)果類似，也與上述研究相符，說明胰島素抵抗大鼠可能存在腎小球高濾過而造成腎小管高重吸收，腎髓質(zhì)小管Na+-K+-ATP酶活性增高，負(fù)擔(dān)加重。胰島素對(duì)健康人、肥胖患者以及糖尿病患者的腎臟鈉轉(zhuǎn)運(yùn)和血壓均有影響。目前已經(jīng)證實(shí)胰島素可以直接影響甚至腎臟中的鈉通道、磷酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Na+/H+交換器NH3以及Na+-K+-ATP酶等的表達(dá)及活性［12］。Sowers JR認(rèn)為:胰島素可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上Ca2+-ATP酶活性，以維持Ca2+濃度最適水平，而在胰島素抵抗時(shí)，這種調(diào)節(jié)降低或消失，使Ca2+濃度增加，導(dǎo)致周圍血管張力增加，血壓升高［13］。但本研究顯示RE組Ca2+-ATP酶活性與正常安靜對(duì)照組和RR組相比無顯著差異，與上述研究不同，或許這和實(shí)驗(yàn)條件不同以及胰島素抵抗程度差異有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

3.3 大鼠血清中GM－CSF水平變化

GM-CSF是一種來源于T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的一種糖蛋白，在炎癥反應(yīng)過程中由損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一種多肽類激素樣造血生長(zhǎng)因子，它可促進(jìn)造血祖細(xì)胞分化成單核巨噬細(xì)胞，并維持單核巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化為炎癥反應(yīng)的敏感的標(biāo)志物［14］。它可刺激骨髓早期母細(xì)胞分化，促進(jìn)成熟和增殖，對(duì)機(jī)體的抗感染、免疫、造血都具有重要的調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用。是聯(lián)系生物體內(nèi)三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要介質(zhì)。它可通過影響網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，引起免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂，特別是表現(xiàn)在T、B細(xì)胞比例發(fā)生紊亂，使CD4/CD8比值發(fā)生改變。［15］

本文結(jié)果表明，RR組血清中GM-CSF水平非常顯著地高于正常安靜對(duì)照組(P＜0.01)，而RE則與正常安靜對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05)，這一結(jié)果表明，血清GM-CSF確實(shí)與胰島素抵抗發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。其升高的機(jī)理有可能是:由于大鼠胰島素抵抗導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能受到抑制，大鼠機(jī)體存在非特異性免疫調(diào)控增強(qiáng)之故。但具體是由于過度活化的T細(xì)胞分泌增加所致，還是其他因子分泌增加所致，抑或是骨髓干細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞異常分泌增加所致尚需深入研究。

3.4 大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值變化

機(jī)體特異性免疫的重要組成部分之一是細(xì)胞免疫，T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞。其中CD4+T細(xì)胞主要是識(shí)別外源性多肽抗原，包括輔助性T細(xì)胞(Th)和誘導(dǎo)性T細(xì)胞(TI);CD8+T細(xì)胞主要是識(shí)別內(nèi)源性多肽抗原，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)和抑制性T細(xì)胞(Ts)兩種。CD4+和CD8+通過相互制約來維持免疫功能的平衡，二者的比值下降提示免疫抑制。

本研究測(cè)定結(jié)果，RE組大鼠外周血CD4活性明顯高于RR組，CD8活性明顯低于RR組，CD4/CD8比值明顯增加。揭示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)胰島素抵抗大鼠的免疫功能有一定的正性調(diào)節(jié)作用。

3.5 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)組間關(guān)系

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其結(jié)構(gòu)、功能的正常與否直接關(guān)系到機(jī)體的免疫功能是否正常。胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟的部位，為中樞免疫器官。人類的胸腺在出生時(shí)就已發(fā)育完全，以后隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸變大，至青春期達(dá)高峰，青春期過后胸腺漸萎縮。脾是人體最大的外周免疫器官，是B淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟的，也是機(jī)體在抗原刺激下發(fā)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所。故胸腺、脾臟結(jié)構(gòu)的衰退和功能下降勢(shì)必會(huì)影響機(jī)體的體液、細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)。胸腺指數(shù)和脾指數(shù)是依據(jù)機(jī)體體重來計(jì)算的，與體重成正比，故胸腺指數(shù)、脾指數(shù)是直接反映胸腺、脾免疫功能的重要指標(biāo)［16］，兩者的高低變化反映了機(jī)體體內(nèi)免疫功能的狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RR組大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于正常安靜對(duì)照組C組，表明RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗明顯降低大鼠體重胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。而RE組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于RR組，則說明耐力運(yùn)動(dòng)能顯著提高模型大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)防病抗病能力。

3.6 研究缺陷和進(jìn)一步研究的方向

本試驗(yàn)只采用了游泳這種單一的練習(xí)方式，沒有設(shè)置專門的力量練習(xí)組。而有文獻(xiàn)認(rèn)為，適當(dāng)?shù)牧α炕蚩棺枇Ψ桨冈O(shè)計(jì)對(duì)不適合進(jìn)行走、慢跑、有氧健身操等練習(xí)的2型糖尿病患者是可行而且有效的。具體采用的運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、頻度、持續(xù)時(shí)間等都還需要更多的運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)進(jìn)行探討。

方案設(shè)計(jì)中缺少了腎臟細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，胰島素抵抗可能會(huì)引起腎臟細(xì)胞更容易凋亡，從而提高糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)率。

4 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)能提高RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠心肌Na+-K+-ATP酶的活性，提高心肌傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力;運(yùn)動(dòng)能夠明顯減少RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠胸腺細(xì)胞凋亡，提高免疫能力。該研究在探討胰島素抵抗患者和糖尿病患者免疫功能下降發(fā)生機(jī)制、臨床治療和預(yù)后判斷方面有重要意義。

［1］Quadro L，Blaner WS，Salchow DJ，et al.Impaired retinal function and vitamin A availability in mice lacking retinolbinding protein［J］.EMBO J 1999;1718:4633–44.

［2］Yang Q，Graham T E，Mody N.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes［J］.Nature，2005，436(21):356-362.

［3］Graham T E，Yang Q，Bluher M，et al.Retinol-binding protein 4 and insulin resistance in lean，obese，and diabetic subjects［J］.N Engl J Med，2006，354(24):2552-2563.

［4］Lim S，Choi S H，Jeong I K，et al.Insulin-sensitizing effects of exercise on adiponectin and retinol-binding protein-4 concentrations in young and middle-aged women［J］.J Clin Endocrinal Metab，2008，93(6):2263-2268.

［5］Ploug T，Stallknecht BN，Pedersen D，et al.Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle［J］.Am J Physiol，1990，259:778-786.

［6］Gravrieli Y，Shergman Y，Schmuel A，et al.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation［J］.J Cell Biol，1992，119(3):493.

［7］Kwiecinski A，Nowak P.Effect of prenatal manganese intoxication on glucose uptake in the brain of rats lesioned as neonates with 6-hydroxydopamine［J］.Pharmacol Rep，2009，61(3):558-563.

［8］Chibalin AV，Ogimoto G，Pedemonte CH，et al.Dopamine-induced endocytosis of Na+，K+-ATPase is initiated by phosphorylation of Ser-18 in the rat alpha subunit and is responsible for the decreased activity in epithelial cells［J］.J Biol Chem.，1999，274(4):1920-1927.

［9］Flack JM，et al.Am J Med［M］，1991，18:11-21.

［10］Smith JM，Paulson DJ，Solar SM.Na+/K+-ATPase activity in vascular smooth muscle from streptozocin diabetic rat［J］.Cardi-ovasc Res，1997，34(l):137-144.

［11］Pollock CA，F(xiàn)ield MJ，Bostrom TE，etal.Proximal tubular cell sodium concentration in early diabetic nephropathy assessed by electron microprobe analysis［J］.Pflugers Arch，1991，418(12):14-17.

［12］Sarafidis PA，Ruilope LM.Insulin resistance，hyper insulin emia，and renal injury:mechanisms and implications［J］.Am J Nephrol，2006，26(3):232-44.

［13］Sowers JR.J Clin Pharmacol，1992，32:529.

［14］Metcal D.Molecular biology and function of GM-CSF［J］.Blood.1986，67:257.

［15］薛宏峰.支氣管哮喘患兒治療前后血清GM-CSF、IL-8和IL-6聯(lián)檢的臨床意義［J］.放射免疫學(xué)雜志，2006年2006，19(6):485-486.

［16］劉茜，劉向國，武松.肺氣腫肺氣虛證模型大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)變化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23(1):20-22.