趙 強，王一洲

膝骨性關節(jié)炎（KOA）是一種常見的慢性關節(jié)疾病，本病多見于中老年人，是影響中老年人生存質量的重要因素。膝關節(jié)是負重關節(jié)，關節(jié)表面覆蓋有關節(jié)軟骨，這層軟骨組織是運動系統(tǒng)的重要組成部分，能降低關節(jié)面的摩擦系數(shù),分散關節(jié)面的壓力負荷[1]。隨著KOA的病程發(fā)展，軟骨細胞的損傷也隨之加重。研究軟骨細胞的變化是探索KOA的病因病機和治療方法的重要途徑。筆者檢索并分析了近十年國內外軟骨細胞的培養(yǎng)和其影響因素的相關文獻，為KOA的深入研究提供證據(jù)。

1 KOA模型的建立

KOA模型的制作方法分為兩類，即誘發(fā)模型，如手術、關節(jié)制動等，以及自發(fā)模型，如STR/ORT小鼠、老年拉布拉多犬等，其主要目的就是為了模擬骨性關節(jié)炎發(fā)病和進展的過程，通過動物實驗觀察軟骨凋亡的誘因以及細胞代謝在分子水平的變化。

1.1 手術造模

1.1.1 Hulth造模法及改良造模法 Hulth造模法是最經典的KOA造模方法之一，具體操作為[2]：無菌條件下，通過吸入2%Halotane麻醉，下肢伸直位于膝關節(jié)內側縱切長約2 cm手術窗口顯露膝關節(jié)，屈曲膝關節(jié)，向外側推開髕骨，保護微血管及脂肪墊，然后切斷前后交叉韌帶,完整切除內側半月板,保留關節(jié)軟骨面，逐層縫合。術后4 d給予口服鎮(zhèn)痛藥，適當給予抗生素預防感染，4 d后不固定傷肢，自由活動。14周后將形成較明顯KOA模型。劉獻祥等[3]對Hulth造模方法進行改良：取兔膝關節(jié)內側入路，切斷內側副韌帶，摘除內側半月板，切斷前交叉韌帶。術后連續(xù)3 d青霉素20萬U肌肉注射，1周后開始每天強迫兔活動0.5 h，連續(xù)16周后，模型組關節(jié)液內白細胞介素（IL）-1、IL-6等炎癥因子的表達明顯升高，且膝關節(jié)的穩(wěn)定性較好。

1.1.2 關節(jié)刻痕造模法 Marijnissen等[4]通過在狗膝關節(jié)股骨髁上刻痕，不損傷軟骨下骨，術后將對側肢體固定于軀體上，迫使手術肢體負重，每周3 d，每天4 h，共20周。40周（后20周正常負重）后，關節(jié)軟骨在組織和生化方面已形成明顯的骨性關節(jié)炎（OA）特點，且應用此法復制的KOA模型具有關節(jié)穩(wěn)定性好、炎癥反應輕的優(yōu)點，適用于輕度或早期KOA研究的應用。李釗等[5]對關節(jié)刻痕法進行改進，手術時定位股骨髁、髕骨及髕韌帶后。緊靠髕韌帶兩側髕骨下方對準股骨髁方向進針,用小針刀在股骨髁軟骨面上刻痕,每側刻痕4~5道,然后調整方向分別在髕軟骨及脛骨平臺上刻痕，盡量不傷及半月板，每道刻痕深度不超過軟骨全層，手術后第2天即開始每日強迫驅趕動物活動30min，驅趕動物活動至5周時,即得明顯的骨性關節(jié)炎模型。此法可以最大限度的減少手術后的炎癥干擾，但由于手術精度較差不能避免一些操作失誤引起的誤差。

1.1.3 關節(jié)失穩(wěn)造模法 朱鴻飛等[6]將16只健康純種成年新西蘭大白兔隨機分為正常組、模型4周組、模型6周組和模型8周組，每組4只。各模型組實驗兔于無菌條件下造成雙后肢膝內側髕韌帶2/3缺損，術后允許其自由活動，手術7 d后每天強迫活動1 h。結果發(fā)現(xiàn)模型6周組表現(xiàn)為膝骨性關節(jié)炎早期改變，模型8周組表現(xiàn)為膝骨性關節(jié)炎中期改變。髕韌帶內側缺損法構建兔膝骨性關節(jié)炎模型，能更好地再現(xiàn)因應力異常而導致的膝骨性關節(jié)炎。Liu等[7]通過對犬膝關節(jié)外側施加68 N和90 N的直接外力，導致其膝關節(jié)內側副韌帶損傷，形成膝關節(jié)不同程度失穩(wěn)的模型，通過有限元模擬力—位移的程度，建立膝關節(jié)失穩(wěn)的不同等級，量化KOA早期應力失常的程度和其影響。王勝等[8]用手術方法延長兔髕韌帶3 mm，降低髕股關節(jié)壓力，術后6周開始出現(xiàn)軟骨細胞增生、排列紊亂，16周時軟骨已明顯變薄，并且出現(xiàn)縱裂紋和膠原纖維增粗、斷裂。

1.2 關節(jié)注射造模 關節(jié)軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨三者合成與降解過程失衡的結果[9]。孫魯寧等[10]運用木瓜蛋白酶誘導兔膝骨性關節(jié)炎，檢測注射后第2、4、6周3個時間點相應組實驗動物的膝關節(jié)滑膜IL-1，IL-6、白三烯的濃度，并與正常側對比，結果發(fā)現(xiàn)膝關節(jié)首次注射木瓜蛋白酶后4周內炎癥因子水平變化顯著（P<0.05）。鄧宇等[11]分別以1.6%木瓜蛋白酶或Ⅱ型膠原蛋白酶溶液注入兔膝關節(jié)，并測試不同濃度的兩種蛋白酶對骨性關節(jié)炎的誘導作用，結果發(fā)現(xiàn)低劑量的膠原蛋白酶可較稍高劑量的木瓜蛋白酶誘導出更為嚴重的軟骨退變。關節(jié)腔內注射化學物建模所需時間短，可模擬軟骨破壞的終末環(huán)節(jié)，適于軟骨病理、藥物防治的研究，尤其是對KOA炎癥反應有較好作用的干預手段。

1.3 自發(fā)模型 Hyttinen等[12]通過在純合形式中Col2a1基因的滅活會阻止軟骨內骨形成，導致小鼠軟骨基質中Ⅱ型膠原纖維的缺失，觀察發(fā)現(xiàn)小鼠關節(jié)軟骨及軟骨下骨膠原網(wǎng)狀結構的變化，證明Col2a1等位基因的失活很可能導致被觀察的關節(jié)軟骨軟化和小鼠骨性關節(jié)炎的高患病率。Simkin等[13]通過觀察不同年齡組的犬類關節(jié)腔的靜水壓和滲透壓發(fā)現(xiàn)，犬類的年齡與關節(jié)液的膠滲透壓正相關。李昊[14]觀察不同年齡兔軟骨細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)成年軟骨細胞直徑大于幼年軟骨細胞直徑，小于老年軟骨細胞直徑（P＜0．01）。

2 KOA軟骨細胞培養(yǎng)

2.1 軟骨細胞分離 高效分離純凈的KOA軟骨細胞是KOA基礎研究的第一步，在軟骨組織工程研究中對種子細胞的數(shù)量要求巨大、生物學功能活性要求高，細胞的來源仍是未很好解決的問題。1967年Manning和Bonner[15]首次把胰蛋白酶和膠原酶結合使用來消化關節(jié)軟骨，把軟骨細胞從堅韌的軟骨基質中分離出來，周強等[16]用三步酶消化法分離培養(yǎng)軟骨細胞，以1 g/L胰蛋白酶和1 g/L乙二銨四乙酸（EDTA）混合液、1 g/L透明質酸酶和2 g/LⅠ型膠原酶順序消化關節(jié)軟骨分離細胞，并檢測細胞收獲效率和存活率，關節(jié)軟骨經三步酶消化基質逐步解離和降解,細胞得以完全釋放和分離,每克軟骨的細胞收獲量平均為50.13×106個細胞,細胞存活率平均為98.18%。李保林等[17]在剪碎的軟骨中加入0.2%Ⅱ型膠原酶5mL，過濾、離心8min，棄上清，加入5mL含有血清的DMEM培養(yǎng)液混勻以終止消化,再離心5min,棄去上清液,只留下細胞球,并加入少量含有血清的培養(yǎng)液吸打后先封口置放。原消化瓶中再加入0.2%Ⅱ型膠原酶5mL,如前法消化45min，消化后的處理同上，取得活細胞率約90%左右。周國順等[18]用酶消化法分離兔關節(jié)軟骨細胞，高密度單層培養(yǎng)并傳代，當單層細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底時用0.25%的胰酶加0.02%的EDTA消化，2∶3傳代，較好的獲取大量優(yōu)良軟骨細胞。

2.2 軟骨細胞培養(yǎng)的調控因素

2.2.1 應力刺激 生物力學因素在骨性關節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用，適度的力學載荷作用于軟骨細胞,可以促進成骨細胞增殖,在載荷作用下,細胞要經歷復雜的信號轉換和傳遞的過程。研究已證明許多細胞表面的離子通道在細胞膜受到機械作用數(shù)秒或數(shù)分鐘后可引起G蛋白活化、第二信使釋放、蛋白質磷酸化、生長因子的分泌、細胞骨架的變化、細胞和細胞外基質黏附的重建、基因表達的改變等[19]。Alexopoulos等[20]用酶解的方法分離出較多的Chondron，經過研究發(fā)現(xiàn)Chondron包含有較多的蛋白多糖和Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ型膠原，其中Ⅵ型膠原為特有的膠原，對力學信號的傳導有重要的作用。Labelle等[21]發(fā)現(xiàn)鈣離子含量變化介導的軟骨細胞增殖主要通過激活瞬時受體電位途徑來實現(xiàn)。Vinardell等[22]對豬膝關節(jié)軟骨細胞加載10MPa靜態(tài)壓力并采用轉化生長因子-β（TGF-β）進行培養(yǎng)，結果檢測到Sox9基因表達較未添加TGF-β培養(yǎng)組增強3倍，糖胺聚糖（GAG）合成也明顯增多，提示應力可使細胞表型及相關基質成分發(fā)生重要變化。

2.2.2 細胞因子 Ray等[23]證明活化蛋白-1（AP-1）和血清淀粉樣蛋白A激活因子-1（SAF-1）具有協(xié)同作用，可作為共活化物介導基質金屬蛋白酶-9（M M P-9）基因的轉錄激活，易致炎性的c-Jun轉錄蛋白可促進犬MMPe-1基因的表達,從而加速關節(jié)軟骨基質降解。童徐等[24]觀察炎性細胞因子IL-1β作用于SD大鼠髁突軟骨細胞后，細胞內源性生長因子TGF-β表達的改變，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞在IL-1β作用下，TGF-β表達增加。田峰等[25]發(fā)現(xiàn)病態(tài)軟骨中 TGF-β1、IL-1β1 的表達比正常軟骨高（P＜0．05）。

3 展望

KOA是臨床常見病、多發(fā)病，KOA模型的建立及軟骨細胞生理特性的的深入研究是探討骨性關節(jié)炎發(fā)病機制的重要步驟。由宏觀向微觀深入、宏觀與微觀相結合是骨性關節(jié)炎基礎研究的基本趨勢。國內對于軟骨細胞各種生物特性的研究才剛剛起步，在實驗設計及操作方案上大多參照國外同類實驗，開發(fā)和生產更適用于國內技術平臺和研究需要的動物模型及軟骨細胞，尤其是利于中醫(yī)、中藥應用的實驗材料，是目前亟待解決的問題。希望能通過多途徑、多靶點的研究證實臨床效果顯著的中醫(yī)藥治療方法，將中國傳統(tǒng)醫(yī)學發(fā)揚光大。

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