由慶軍 杜依燃

1 資料與方法

1.1 一般資料 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤, 具有侵襲性生長, 無控性增殖, 易復(fù)發(fā)特點(diǎn)［1,2］。Kif2a基因定位于5q12.1上, 具有微管解聚酶的作用, 沿著微管作單向運(yùn)動［3］, Nakamura［4］發(fā)現(xiàn) , 在胃癌癌組織中 Kif2c的mRNA在多數(shù)原發(fā)腫瘤中的表達(dá)高于配對的癌旁組織。但驅(qū)動蛋白Kif2a在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用至今尚未見報道。本研究中, 作者檢測30例原發(fā)瘤組織及相應(yīng)的瘤旁標(biāo)本Kif2a表達(dá)情況。結(jié)果Kif2a在原發(fā)組織中高表達(dá), 在癌旁低表達(dá), 并且在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平一致。沉默Kif2a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。因此, Kif2a有望成為腦膠質(zhì)瘤早期診斷標(biāo)志物。

1.2 材料

1.2.1 細(xì)胞和腫瘤標(biāo)本

U87培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基, 于37℃、5% CO2培養(yǎng)至對數(shù)生長期。30例標(biāo)本均取自2004～2010年吉林市中心醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞患者。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。分別以 100 nmol/L siRNA 和 2 μl Lipofectamine 2000各溶于50 μl培養(yǎng)基, 孵育5 min后混合20 min, 緩慢滴入置于500 μl OPTI-DMEM無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中, 轉(zhuǎn)染48 h后用于基因表達(dá)檢測和體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR 采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物, PCR 反應(yīng)條件為50 ℃ 溫育2 min, 95 ℃預(yù)變性3 min, 95 ℃變性30 s,60℃退火延伸1 min, 40個循環(huán)。每個樣本均設(shè)3個副孔?！鰿T值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差, 2-△CT則為該樣本中Kif2a相對于GAPDH mRNA的表達(dá)量。

1.2.4 Western blot Western blot依據(jù)［5］所進(jìn)行

1.2.5 Transwell和MTT 將懸浮于500 μl無血清培養(yǎng)基的5×104個 U87-siControl、 U87-siKif2a-1和 U87-siKif2a-2細(xì)胞接種于含Metrigel和不含Metrigel的transwell上室, 下層加入750 μl含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液, 培養(yǎng)8 h。取出transwell小室,通過3步染色試劑盒固定、染色, 自來水漂洗3次, 室溫風(fēng)干,鏡下觀察穿孔細(xì)胞數(shù)目。MTT法依據(jù)［6］所進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別將病例分類為Kif2a mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組, 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。P< 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Kif2a在原發(fā)瘤組織和配對正常組織差異表達(dá) 檢測30例原發(fā)瘤和配對瘤旁正常腦組織病例中Kif2a mRNA和蛋白表達(dá), 結(jié)果表明25例患者組織中Kif2a表達(dá)量較配對瘤旁正常腦組織上調(diào)3倍, 卡方檢驗(yàn)證實(shí)原發(fā)組織中較配對瘤旁正常腦組織中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)。

2.2 沉默Kif2a表達(dá)以及對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響 檢測U87、siControl、siKif2a-1和siKif2a-2中Kif2a mRNA和蛋白表達(dá), 結(jié)果沉默Kif2a表達(dá)的U87細(xì)胞中Kif2a 的mRNA和蛋白表達(dá)較對照細(xì)胞均顯著下調(diào)。MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示, siKif2a-1和siKif2a-2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力較對照細(xì)胞和親本細(xì)胞降低。

3 討論

Kif2a-siRNA處理人類乳腺癌細(xì)胞和用Kif2a抗體干擾的蟾蜍卵中出現(xiàn)單極紡錘體的形成和細(xì)胞增殖的阻斷,其功能異常可能會導(dǎo)致基因組不均衡, 最后腫瘤發(fā)生。Wang等［7］研究發(fā)現(xiàn), Kif2a在口腔癌組織中高表達(dá)。以上研究提示,Kif2a表達(dá)與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Kif2a作為促癌基因, 我們推測其在腦膠質(zhì)瘤中可能存在異常表達(dá)并與腫瘤細(xì)胞侵襲遷移存在相關(guān)性。目前, 對于Kif2a在腦膠質(zhì)瘤惡性腫瘤中的表達(dá)及其與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的關(guān)系研究尚未見報道。我們發(fā)現(xiàn), Kif2a在原發(fā)瘤組織中表達(dá)量比配對瘤旁正常腦組織上調(diào)3倍。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默Kif2a表達(dá),細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力較對照降低。因此, 我們推斷Kif2a可作為評價腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的一個重要因子。

［1］Alves TR, Lima FR, Kahn SA, et al.Glioblastoma cells: a heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.Life Sci, 2011, 89(15-16):532-539.

［2］Norden AD, Drappatz J, Wen PY.Antiangiogenic therapies for highgrade glioma.Nat Rev Neurol, 2009, 5(11): 610-620.

［3］Ems-McClung SC,Walczak CE.Kinesin-13s in mitosis:Key players in the spmial and temporal organization of spindle microtubules.Semin Cell Dev Biol, 2010, 2 1(3):276-282.

［4］Y Nakamura, F Tanaka,N Haraguchi,et al.Clinicopathological and biological significance of mitotic centromere-associated kinesin overexpression in human gastric cancer.British Journal of Cancer,2007, 97(4):543-549.

［5］Mao Y, Xu J, Song G, et al.Twist2 promotes ovarian cancer cell survival through activation of Akt.Oncol Lett, 2013,6(1):169-174.

［6］Li Z, Zhang Q, Mao JH, et al.An HDAC1-binding domain with in FATS bridges p21 turnover to radiation-induced tumorigenesis.Oncogene, 2010, 29(18):2659-2671.

［7］Cheng-Qin Wang, Xun Qu, Xiao-Ying Zhang, et al.Overexpression of Kif2a promotes the progression and metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue.Oral Oncology, 2010, 46(1):65-69.